在荧光显微镜的基本原理是细胞成分有荧光剂的帮助的非常具体的可视化。这可以是荧光蛋白-例如绿色荧光蛋白-基因与感兴趣的蛋白质。如果克隆是不可能的-例如组织学标本中-这是需要使用其他技术，如免疫荧光染色来可视化目的蛋白质。用于此目的的抗体的利用，这是可以直接或间接地连接到不同的荧光染料和结合到适当的目标结构。此外，与荧光染料的徕卡显微镜的帮助下，不仅限于蛋白，但它也提供了机会染色核酸，多糖和其他结构。可以检测甚至非生物物质，如钙离子。本文介绍了常用的荧光剂。

    荧光免疫

    在荧光显微镜有两种方式来可视化你的目标蛋白。无论是与一个固有荧光信号的帮助下-这意味着通过克隆，因此基因连接的荧光蛋白与靶蛋白。或借助荧光标记的特异性结合到感兴趣的蛋白质的抗体。对于一些生物的问题是比较有用的，甚至需要进行后者。在组织学样品的情况下，例如，它不可能使用的，因为在一般的样品被从其中不持有任何荧光蛋白的生物来源的荧光蛋白。此外，如果一个有效的抗体可用，免疫比荧光蛋白技术快得多，是你要克隆的兴趣和转染的DNA的基因插入到适当的细胞。荧光蛋白的另一个缺点在于身为蛋白质本身的性质。有了它，它们具有可导致功能障碍或误解关于感兴趣的附着蛋白的细胞内特定蛋白质性的特点。然而，应当认为，使用荧光蛋白是通常选择的方法来观察活细胞。

    免疫荧光法利用抗体与其抗原的非常特异性结合亲和力的。这可以有两种不同的外观。最简单的方法是使用一种被结合到感兴趣的蛋白的荧光标记的抗体。这就是所谓的直接免疫荧光。

    在大多数情况下，有两种形式的抗体的使用。第一个结合靶蛋白并没有荧光标记本身（第一抗体）。但是，第二个（第二抗体），其结合第一抗体特异性带有荧光染料。这种方法被称为间接免疫荧光和具有若干优点。一方面有一个放大的效果，因为多于一个的第二抗体结合于一个第一抗体。另一方面，没有必要所有的时间标记每个抗体对您喜欢的蛋白与荧光染料而使用的商业荧光标记的第二抗体。广泛使用的荧光染料的免疫是FITC，TRITC或都提到了以下几个Alexa的Fluor®染料。

    FITC和TRITC

    异硫氰酸荧光素（FITC）是有机荧光染料仍然在免疫荧光和流式细胞术使用。它的激发/发射峰在517分之495nm和可耦合到不同的抗体，其反应性异硫氰酸酯基，其上结合的蛋白质的氨基，巯基，咪唑基，酪氨酰基或羰基的帮助。它的基本形式-荧光素-具有332克/摩尔的摩尔质量，并经常被用来作为荧光示踪剂。FITC（388克/摩尔），这是用于荧光显微镜和服务为原点进行进一步的荧光染料类的AlexaFluor®488第一的染料之一。其荧光活性是由于其大的共轭芳族电子系统，它是由光的蓝色光谱激发。

    图1：果蝇胚胎发育，绿色：FITC，红色：TRITC图2：小鼠成纤维细胞，绿色F-肌动蛋白，FITCRed：Tubulin，Cy5，蓝色：细胞核，DAPI

    很多时候同日而语用FITC使用的染料是它的发音相似的伙伴TRITC（四甲-5（6）-isothiocyanate）。相反，FITC，TRITC不是荧光素，但罗丹明家族的衍生物。罗丹明也有一个大的共轭芳族电子系统，是什么导致了它们的荧光行为。相反，FITC，TRITC（478克/摩尔）为激发光在绿色光谱，最大在550nm处。其最大发射是在撒谎，在573纳米。键合到蛋白质（如抗体）也基于反应性异硫氰酸酯基团。

    即使FITC和TRITC仍然在使用，它们是相当弱的荧光染料和不推荐用于本领域显微镜的状态。他们的利润是根据自己的经济代价。

    花青

    这种相对小集合荧光染料是来自菁这也是起源于他们的名字的Cy2，Cy3，Cy5和Cy7标记。所有的人都可以通过它们的反应性基团被连接到核酸或蛋白质。对于蛋白质性标签使用的马来酰亚胺基团，例如。有趣的-有关荧光-Cy5的是其电子周围敏感。这可以用于酶测定。的附连蛋白导致正的或负的变化中的荧光发射的构象变化。此外Cy3和Cy5可用于FRET实验。花青染料是比较老的荧光染料和依据其他荧光染料具有改进的亮度，耐光性，量子产率等。

    AlexaFluor®染料

    AlexaFluor®染料这是经常使用的荧光显微镜一大群的带负电荷的亲水性和荧光染料。他们的称谓可追溯到它的发明者理查德·保罗·豪格兰谁任命他的儿子亚历克斯毕浩然后的染料。该标签是分子探针（生命技术的附属公司）的注册商标。此外，各激光的激发波长中提到他们的标签。例如在非常广泛使用的AlexaFluor®488具有最大激发，在493纳米，它允许励磁用标准488nm的激光。AlexaFluor®488具有发射最大值在519纳米。与此特征，AlexaFluor®488具有非常相似的性质，以FITC。虽然AlexaFluor®488是荧光素衍生物，而相比之下，FITC它具有更好的稳定性，亮度和较低的pH敏感性。所有的AlexaFluor®染料是不同的基本的荧光物质如荧光素，香豆素类，花青或罗丹明（如AlexaFluor®546，AlexaFluor®633）的磺化形式。它们的摩尔质量范围为410至1400克/摩尔。

    图3：转基因小鼠胚胎，interlimb体节，在10。5天的转基因小鼠胚胎的五interlimb体节：EpaxialMyf5绿色荧光蛋白；免疫染色的GFP-Alexa的488；沾上结蛋白，Cy3的胚胎肌纤维，细胞核被发现用Hoechst大小从上到下：3。5毫米（一），800微米（B）。奥莉乔瑞，CellulesSouches与发展协会，巴斯德研究所，法国巴黎和IGBMC，IGBMC成像中心：礼貌

    图4：小鼠成纤维细胞，绿色F-肌动蛋白，FITC红：微管蛋白，Cy5，蓝色：细胞核的DAPI。君特·吉斯博士，马普医学研究所，德国海德堡：礼貌

    DNA染色

    在荧光显微镜不仅蛋白质结构的利益，也有核酸。有时有必要通过其核的检测，以确定细胞的确切位置或数量。一种最常见的DNA污斑是DAPI（4'，6-二脒-2-苯基吲哚），其结合在DNA双螺旋结构的丰富的区域。DAPI荧光强度增加，如果附着的DNA相比，其未绑定状态。据兴奋紫外光，最大的358纳米。发射谱很广，在461nm的峰值。弱荧光，也可用于RNA结合检测。在这种情况下，发射偏移到500nm。有趣的是，DAPI是能够渗透完整的细胞膜。因此，它可以在固定，以及在活体细胞中。

    第二个广泛使用的DNA染色方法是染料Hoechst公司，它最初是由化工企业赫斯特公司生产的家庭。赫斯特33258，赫斯特33342，和赫斯特34580顷双-benzimides与嵌入倾向的AT丰富的地区，于是后者不使用非常频繁。类似DAPI它们通过紫外光激发而具有发射最大值在455纳米，它被移动到510-540毫微米以未结合状态。Hoechst的污渍也被细胞渗透性，可以在固定和活细胞，因此可以使用。的差异，以DAPI是其较低的毒性。

    一种膜防渗的DNA染色是丙啶，碘化物。它，它通常用于在细胞培养活细胞和死细胞之间进行区分，因为它不能老是进入完整细胞。Propidium-碘化物也嵌入剂，但没有约束力的偏好不同的碱基。在核酸结合的状态下，其最大激发是在538纳米。最高排放为617纳米。未绑定丙啶，碘激发和发射最大值被移到较低的波长和强度较低。它也可以结合RNA，而不改变它的荧光特性。区分的RNA的DNA，需要使用适当的核酸酶。

    染料，其能够使以前无操纵的DNA和RNA之间的差是吖啶橙。它的激发/发射最大对在DNA的破解版502纳米/525纳米和转向460纳米/650纳米的绑定RNA的状态。此外，它能够进入酸性隔室等溶酶体。有阳离子染料被质子化。在此酸性吖啶橙周围被光在蓝色光谱激发的，而发射是最强的橙色区域。由于细胞凋亡有很多吞没酸性车厢这使得它经常被用来标记那些类型的细胞。

    舱和细胞器的特定染料

    图5：Pukinje细胞，小鼠小脑皮质的三重标记矢状窦旁一节。红色：抗钙结合蛋白-D28K/Cy3的，绿色环保：抗GFAP/Cy5的，蓝色：赫斯特33258

    图6：牛肺血管内皮细胞。红色：线粒体标记MitoTracker®红CMXRos，绿色F-肌动蛋白标记的绿色荧光BODIPY®FLphallacidin，蓝色：DAPI标记的细胞核。使用3D盲解卷积此图像增强

    在荧光显微镜中是经常合理染色细胞区室像溶酶体或内体和细胞器像线粒体。为此，有将在本节中提到的具体可用染料的调色板。

    一种公知的方法来观察线粒体是MitoTracker®的利用率。这是一种细胞渗透性染料有轻微巯基反应性氯部分。有了它，就可以通过共价键与半胱氨酸残基的游离巯基反应结合到基质蛋白。MitoTracker®存在以不同的颜色和修改（第表1）和是MolecularProbes公司的一个注册商标。相反，如罗丹明123或tetramethylrosamine传统线粒体特定污渍，MitoTracker®不破坏膜电位与固定剂后冲了出去。

    根据线粒体的污渍也有染料标记的酸性区室像溶酶体被称为LysoTracker。这些都是链接到荧光膜渗透性弱碱性。很可能这些碱有，因为质子的酸性区室的亲和力。LysoTrackers也以不同的颜色（S表1）可用。

    一个可比较舱溶酶体是像酿酒酵母真菌液泡。此膜的封闭空间是酸性性质也。可视化它在荧光显微镜中的一种方法是使用苯乙烯基染料等调频4-64®或FM5-95®。

    当涉及到蛋白分泌实验，内质网（ER）是一种特殊的兴趣。一个经典的染料来染色这个车厢是DiOC6（3）。它有一个偏好的急诊室，但仍绑定到其他膜像线粒体。另一种方法特异性染色质网是用ER-跟踪器一样ER-跟踪绿色和红色。两者都是它们与格列本脲肾上腺素类染料-一个sulfonylurease-它结合到ATP敏感性钾通道的完全驻留在ER膜。BODIPY（硼-二吡咯亚甲基）描述了一组相对pH值不敏感的染料几乎都是水不溶性的。这并没有使他们的蛋白质标记，但脂质和膜标签的一个很好的工具。

    相邻的车厢内质网-高尔基appararatus-可以用荧光神经酰胺类似物如NBDC6-神经酰胺和BODIPYFLC5-神经酰胺。神经酰胺是鞘脂的高度富集于高尔基体。

    随着进一步基于脂质染料的帮助有可能弄脏特殊膜区域样脂质筏。这些富含胆固醇的结构域可以通过使用NBD-6胆固醇或NBP-12胆固醇除其他（Avanti极性脂质）被可视化。

    除了使用特殊的非proteinacous荧光染料标记的细胞区室，也可以染色的与蛋白质的帮助下与偏好在小区的不同位置感兴趣的区域。这些蛋白质可以被链接到的荧光染料和可视化的荧光显微镜。一个示例为这样一种方法是麦胚凝集素（WGA）的用法，其特异性地结合于唾液酸和N-乙酰葡糖氨基存在于质膜上。WGA被耦合到荧光染料。与之质膜可以被观察到。

    离子成像

    在神经元的研究中，基因的活性或细胞运动的情况下-例如-它是感兴趣了解的细胞中的离子浓度。钠，钙，氯离子或镁离子具有在许多不同的细胞事件的深刻影响。通常，离子可被捕获与荧光标记的螯合剂，当绑定到适当的离子而改变它们的光谱性质的帮助。这个原理体现在钙指标呋喃-2，吲-1，荧光-3，荧光4和钙绿，例如。

    钠检测，SBFI（钠结合benzofurzanisophthalate）或绿色钠是常用的。PBFI（钾结合苯并呋喃间苯二甲酸）检测钾离子。

    有趣的是也有基于蛋白质的钙指标。其中之一是基于化学发光的水母蛋白水母发光蛋白。水母发光蛋白的发光团腔肠素，分子氧和Ca2+的相互作用导致了蓝色的光的释放-在荧光蛋白的发现非常突出的机构。

    荧光染料和它们的激发和发射波长的峰

    所有上面提到的染料列于下表中。另外附加的荧光染料，其激发和发射波长峰相提并论。