荧光显微镜的基本操作及注意事项

    1．荧光显微镜基本操作步骤

    (1)安装紫外防护罩。

    (2)打开高压汞灯的电源控制箱开关。

    (3)插入挡光板，中断光路。

    (4)预热5―10分钟。

    (5)将载有样品的载玻片放到载物台上。

    (6)选择接物镜(按照先低倍，后高倍顺序)。

    (7)旋转分光镜组件转盘，选择所需要的分光镜组件：“O”为观察透射光时用；“WU”为观察蓝色荧光时用(如DAPl)；“WB”为观察绿色荧光时用(如FITC)；“WG"为观察红色荧光时用(如TRITC)。

    (8)使用阻断滤片(目前多数阻断滤片内置于荧光显微镜)。

    (9)通过粗、细螺旋调整焦距。

    (10)打开与显微镜连接的计算机，点击数码成像系统软件，采集数码图像。

    2．荧光显微镜使用注意事项

    (1)因观察荧光使用的光源为高压汞灯，其中发出的光含紫外光，对人眼有损害作用，故必须安装紫外防护罩。为了避免紫外线对眼睛的伤害，调节光源时需要带上防护眼镜。

    (2)为延长汞灯寿命，打开汞灯后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15分钟后才能关闭。

    (3)汞灯熄灭后待完全冷却才能重新启动，否则灯内汞蒸气尚未恢复到液态，内阻极小，再次施加电压，会引起短路，导致汞灯爆炸。这样不仅损坏电器，更重要的是汞蒸气溢出，将导致工作室污染。故关闭汞灯之后，不能马上再次打开，必须等待至少30分钟。

    (4)高压汞灯工作时会散发大量的热量，因此，工作环境温度不宜太高，必须有良好的散热条件。

    (5)汞灯的使用寿命约200―300小时，在电源控制箱上有时间累计计数器，使用者要记录累计小时数，达到300小时，需更换新灯泡，否则亮度不够，影响观察。由于光源是有一定使用寿命的，所以一切步骤都需要节约时间，从而保护光源，让它的使用寿命最长化。

    3．荧光显微镜标本制作特点和观察要求

    (1)载玻片：载玻片厚度应在0．8―1．2mm之间，玻片太厚吸收光多，激发光难以在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。

    (2)盖玻片：盖玻片厚度应约0．17mm，光洁。为加强激发光，也可用干涉盖玻片，这种特制盖玻片的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质(如氟化镁)，它可以使荧光顺利通过而反射激发光，这种反射的激发光可激发标本中的荧光。

    (3)标本：组织切片或其他标本不能太厚，一般以5～20pm为宜，切片太厚可使激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察的标本上部不能被激发。切片折叠或杂质过多均可影响荧光的观察。

    (4)封片剂：封片剂必须无自发荧光、五色透明。加上抗淬灭剂后再用指甲油(实际操作中体会指甲油封片效果很好，可做到薄而均匀)将盖玻片四周封固，既保持盖玻片不滑动，又能防止抗淬灭剂蒸发。在没有抗淬灭剂的情况下，也可使用含30％甘油的PBS，还可用甘油与0．5mol／L碳酸盐缓冲液(pH9．0～9．5)等量混合液作封片剂。

    (5)镜头的清洁：在油镜使用完毕后，需用擦镜纸沾上无水乙醇或3：7的醇醚混合液轻轻擦拭。

    (6)及时观察：标本染色后应及时观察，因时间过长荧光会逐渐减弱。若标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间。

    作为光学显微镜的其中一个分支，荧光显微镜被广泛应用在免疫荧光细胞化学研究中。它的光源比较特殊，是紫外线，被紫外线照射过的被检物体会呈现出荧光，从而被研究者进行观察分析。

    一、荧光显微镜与普通显微镜区别

    1、光源：普通显微镜采用的是普通的自然光，而它采用的是波长短，分辨率高的紫外线。

    2、照明方式：荧光显微镜采用的是较为特殊的落射式，将光源直接投射在样品上。

    3、滤光片：为了保护观察者的眼睛，荧光显微镜在目镜和物镜之间安装了可以过滤掉伤眼的紫外线的滤光片。

    二、使用方法：

    1、第一步首先要将灯源打开，然后预热十五分钟使之达到最亮。

    2、先用低倍镜进行观察，调整装置，使光源的中心处于照明光斑的正中央，便于观察。

    3、放置被观察的而物质。切忌，要在安装滤光片之后再行观察。因为紫外线会大大损害人的眼睛。

    体视荧光显微镜的应用与注意

    一、将材料片放在显微镜的载物台上。

    二、打开荧光显微镜稳压器，然后启动紫外灯，紫外灯15min内不得关闭，关闭后3min内不得再启动。

    三、将激发滤光片转至v，分色片调到v，选用495或475nm阻挡滤光片。

    四、选用uvFL40、uvFL100荧光接物镜镜检。

    五、在玻片上加无荧光油，先用40x，再用100x调焦镜检．呈现荧光。

    六、因荧光物质受紫外光照射时随时间的增长荧光逐渐变弱，因此镜检时应经常变换视野。

    七、亦可用uvFL10或uvFL20低倍镜镜检材料(用低倍镜时不加无荧光油)。

    荧光图像的记录方法：

    荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须将二者结合起来综合判断。结果记录根据主观指标，即凭工作者目力观察。作为一般定性观察，基本上可靠的。随着技术科学的发展，在不同程度上采用客观指标记录判断结果，如用细胞分光光度计，图像分析仪等仪器。但这些仪器记录的结果，也必须结合主观的判断。

    荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很易褪色减弱，要即时摄影记录结果。方法与普通显微摄影技术基本相同。只是需要采用高速感光胶片如ASA200以上或24。以上。因紫外光对荧光猝灭作用大，如FITC的标记物，在紫外光下照射30s，荧光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。一般研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微摄影系统装置。

    荧光显微光学系统需要优先考虑的是:

    (1)光学系统组成的材料应选用在激发光波内无荧光材料,不但指光学系统玻璃也包括胶合制造中的胶合剂、切片、盖玻片和浸液以及密封剂。若有自发荧光,不但会增加背景光,有时还会混淆观察荧光图像。

    (2)光学系统的参数选择中,应将获得最大光能作为第一考虑因素。

    照明系统中集光镜应选用最大的包容角;采用柯勒照明并使灯丝或弧光像充满入瞳,以期望获得高效率的均匀照明。

    收集荧光成像的物镜,因为像面照度与数值孔径NA2成正式,为此作为荧光用物镜应有较大的NA值。目前10×已达015;20×达0175;40×达019;油镜40×达113。

    双目镜筒作为荧光用时应在可见光谱段有较高的透过率,采用镀膜技术可大大地减少光能的损失,它可比一般双目镜筒透射率提高一倍,这对弱荧光物质观察是必须的。

    目镜放大率不宜选大,因为象面照度与目镜放大率平方成反比。若其它条件相同,当用613×目镜时,照度定为100%,换上1215×时,照度约为25%,因此常在4×～613×之间选用。

    由此表明,用不同物镜和目镜组合成同一倍率的显微镜时,象面照度和曝光系数可相差数倍,对于荧光观察最佳组合是选用低倍率目镜和NA大的物镜最为合适。

    (3)作为荧光光学系统各组成部件的光谱特性也是至关重要的,特别是紫外光要通过的部件,如照明系统,聚光镜以及物镜,要关注紫光区的透射系数。聚光镜要选用透紫外线的材料。照明系统中反光镜表面镀铝比镀银好,因为铝在UV和V区反射率在90%以上,而银仅达70%。加拿大胶吸收紫外线,在紫外区通过处不宜用作胶合剂。