用复式光学显微镜进行的线性测量通常覆盖约25mm至0.2um的长度范围，上下边界主要由最大视场直径和显微镜分辨率极限确定。本互动教程探讨了用载物台测微计校准各种目镜标线，并演示了如何使用标线来确定线性标本尺寸。

   本教程使用水平刻度的目镜中间掩模版进行初始化，该掩模版具有八个主要的划分规则（标准尺度中间掩模版），出现在视口上，叠加在载物台测微尺上，并且是随机选择的物镜放大倍率。要操作本教程，请使用X平移和Y平移滑块操纵目镜标线板后面的载物台测微尺。载物台测微尺平移分辨率的控制由“滑块平移调整”单选按钮确定，该按钮启用“粗”（默认）和“精细”测微尺刻度尺相对于标线尺的位置。在粗糙模式下，将测微尺放置在标线片的后方，并在“粗略”模式下单击“精细”单选按钮，然后将其中一个测微尺规则（最好是编号为100um的间隔线）与目镜的最左手规则进行匹配掩模版（默认掩模版上编号为“0”）。

   十字线和载物台测微尺的刻度对齐后，使用鼠标光标在目镜十字线的左手规则（标记为“0”的规则）上单击叠加规则，以建立校准基线。单击鼠标按钮时，将在光标所在的位置出现一条红线（基线）。接下来，将光标移动到基线右边的另一个位置，在该位置处，标线和载物台测微尺再次完美对齐。再次单击鼠标按钮，将出现第二条红线（校准线）。基线和校准线之间的距离（以um为单位）将显示在视口的右下角的黄色框中，标题为“测微尺长度”。同时，主十字线标线（称为“十字线细分”）之间的计算值（也以um为单位）将显示在视口的左下角的黄色框中。现在可以将后一个值用于测量样本尺寸。

   对标线进行校准后，单击位于视口右上角的“标本”单选按钮，标本将出现在视口中（从“选择标本”下拉菜单中选择）。为了测量样本特征，请使用X平移和Y平移滑块将特征的边缘与目镜标线片上的左手规则（标为“0”的规则）对齐。接下来，在标本特征的相对边缘上单击鼠标光标以执行测量。测得的样本尺寸（以um为单位）将显示在视口的右下角的黄色框中，标题为“样本测量”。通过从“选择标本”下拉菜单中选择一个候选标本，可以使用相同的校准（和物镜放大倍数）来测量新标本。为了增加时，它叠加在样本用光罩的知名度，选择一个新的标线颜色（红色是默认值）从十字线颜色下拉菜单（选用的是黑，白，红，黄）。

   可以通过从物镜放大率下拉菜单中选择不同的放大倍率来执行其他物镜/目镜掩模版校准。此外，可以从“选择标线”菜单中选择新的标线。这些操作（选择新的放大倍率或新的标线片）中的任何一个都会重新初始化教程，并使访问者能够开始另一个校准。

   线性标线（标准标度，十字线，风车）用于线性测量，而网格标线（方格，计数网格，同心圆和Miller正方形）用于颗粒计数。后面的标线也可以按照上面针对线性测量所述的方式进行校准。所述测厚仪光罩是用于比较纤维和颗粒的相对尺寸是有用的。通过将编号为20的规则集与载物台测微尺上的刻度对齐来校准此标线。

    标线标定和标本线性测量

    特定物镜的目镜标线片的校准（确定测微尺刻度关系）通常是按照以下推荐的步骤进行的（另请参见图1）。请注意，目镜标线片的校准仅适用于要测试的特定物镜/目镜组合以及显微镜的特定机械镜筒长度。为避免不必要的重复操作，应记录每种组合的校准信息并将其存储在显微镜工作站附近的方便位置。

•    确保将显微镜对准并配置为用于Köhler照明后，将适当的标线片插入显微镜目镜并调节目镜，以使刻在玻璃标线片表面上的刻度清晰聚焦。仔细检查掩模版的方向，以确保刻线上方或下方的数字没有颠倒。可以通过将目镜保持在明亮光源的前面并通过目镜凝视来完成此任务。最后，调整显微镜的双眼瞳孔间距，并记录该值以进行后续测量。如果显微镜在两个目镜上都装有补偿调节装置（大多数现代显微镜就是这种情况），则标线片校准值对于任何瞳孔间距都是正确的。

•    将载物台测微尺放在显微镜载物台上，并使用显微镜的粗调和细调焦控制旋钮将测微尺刻度对准焦点。通过使用低倍物镜首先确定围绕标尺的圆，然后再确定标尺本身，可以方便地检测到标尺并将其转换为视场中心。肉眼可看见环绕测微尺刻度的环，应将其用于将载物台测微尺放置在显微镜光路（载物台孔径）的中心。此外，数个测微尺设计在环和刻度尺边缘之间刻有一条线，这在使用高放大倍率物镜时也有助于定位刻度尺。

•    使用x - y移动控制旋钮或手柄平移载物台，和/或旋转目镜（及其标线片）以使两个刻度平行对准（图1（a）和1（b））。现代机械平台通常具有围绕显微镜光轴的有限程度的旋转运动。在这种情况下，松开翼形螺钉（通常位于样品台的前部，在标本平台的下方），然后旋转样品台，直到测微尺和目镜掩模版平行。

•    将目镜标线片直接放在测微尺上（带有镜台控件），并将标线片中的左手定线与镜标测微尺上较长的编号（100um）分隔线之一对齐（图1（b））。根据物镜的放大倍数和目镜的视场直径，目镜中可见的距离在150um至4mm（载物台测微尺刻度的长度的两倍）之间。在载物台测微尺的100到1000um（10到100条规则）的距离上，确定标线和测微尺刻度精确匹配的两个点（见图1）。为了获得最准确的测量结果，请在两个刻度上使用最大可能的除法范围。偶尔只有标线片和载物台的测微尺刻度在目镜可见的整个长度上重合，但是通常是针对特定目镜制造的标线。最后，参照载物台测微尺上的刻度确定目镜刻度的表观长度。

•    使用的物镜的测微尺值可以通过将镜台测微尺的选定区域的已知长度除以目镜刻度的相应划分数来计算。结果将得出物镜标度上每个刻度的距离，该量通常称为 校准常数。图1（b）中叠加在标尺测微尺上的标线片表示标线板上的左标尺（标为0）与标有20的标尺测微尺的对准。为了清楚起见，两条规则的重叠部分用红线表示。下一个重叠区域发生在载物台测微尺上标有30的规则与7.5一致的地方在目镜标线上 因此，载物台测微计的100um区域等于7.5标线划分。因此，对于要校准的特定物镜/目镜组合，目镜分划板的每个分区对应于13.3um。应当仔细检查适合计算掩模版校准的有效位数。由于光学显微镜中的最小可分辨距离约为0.2um（在最佳情况下），因此无法准确确定低于此值的线性测量。

•    使用配备了变焦光学系统的体视显微镜进行精确测量时，有必要为显微镜上的每个变焦设置使用一个测微计。尽管许多显微镜变焦环和控制旋钮都是用标称物镜放大倍数进行刻度的，但实际上不可能将变焦控制返回到完全相同的位置，这是进行精确测量的必要条件。

•    用载物台测微尺校准目镜掩模版后，可以测量样品的线性尺寸。对于所有测量，应选择最高的放大倍率物镜，以使整个感兴趣的标本特征落入标线刻度范围内。仔细检查标线片刻度的方向使其与标本区域的轮廓一致。接下来，移动标本，直到左边缘与目镜掩模版上的编号线重合，然后计算目标区域所跨越的刻度范围数。仔细估计除法的任何分数。为了提高准确性，请对大型样本进行几次测量。在测量圆形或椭圆形样本（例如血细胞，酵母，细菌等）时，请记录至少20个来自不同领域的候选对象的尺寸。

   当然，对于要用于线性测量的每个物镜，必须重复上述校准程序。应当注意，对于刻有相同放大倍数（例如10倍）的相似物镜（即使来自同一制造商），其放大率也有几个百分点的变化，因此每个物镜应独立测量。如果显微镜经常用于许多不同的物镜，则以图形形式绘制每个物镜的校准曲线可能会更方便。这提供了一种简便的机制，可以在使用显微镜时快速确定特征尺寸，而不必在对用于执行测量的所有物镜应用测微尺值时重复进行算术运算。

   上述校准过程提供了对于特定光学组合有效的因数，而无需了解实际物镜放大倍数，该倍数通常与印在物镜镜筒上的标称倍率不同。在使用包含校正项圈的物镜以适应盖玻片厚度的变化时，重要的是要记住，放大率会随着项圈的不同设置而变化。因此，为此目的确定的校准系数仅在用于校准的校正套环设置下有效。具有可调节套环的物镜可对各种盖玻片厚度进行校正，但在整个调节范围内也可显示高达15％的放大倍率变化。