宽视野，共聚焦和多光子荧光显微镜提供的多种成像模式，可以对生化特异性高的固定细胞和活细胞和组织进行非侵入性的，时间分辨的成像。尽管具有传统荧光显微技术的优势，但此类技术的空间分辨率受到光衍射（衍射屏障）的限制。这限制了可以用标准显微镜物镜捕获的信息量，通常将光学显微镜限制为表征微米级而非纳米级结构。超分辨率显微技术采用了新颖的方法来绕过衍射屏障，使用户可以通过光学系统获取纳米级信息。

   STORM成像的基本原理。（a）用荧光团标记的细胞中的微管插图。（b）强激光激发将大多数荧光团推至暗态，单个荧光团可能从该状态随机返回发射态（以黄色突出显示），确定了质心位置（以黑色叉号表示），并最终映射到单个复合超材料中分辨率重建（f）。单个发射器记录在大量帧（ce）上。

   随机光学重建显微镜STORM是获得诺贝尔奖的超分辨率单分子定位显微镜（SMLM）系列之一，用于可视化生物系统，其光学分辨率在x，y处为数十纳米（nm）。和z方向。该技术在哈佛大学的庄小伟的实验室中首创，可通过尼康的N-STORM系统获得。类似的SMLM技术还包括光活化定位显微镜（PALM）和基态耗竭单个分子返回（GSDIM）。

   STORM和其他SMLM在概念上是相似的技术：利用荧光团的光化学特性来诱导弱发射或非发射“暗”态。从黑暗状态开始，非常少的（理想）荧光团会返回到发射状态，并被激发并被检测到。然而，为了被识别，发射轮廓必须在每个图像中表现出最小的重叠。每个识别出的分子的质心位置在统计学上都适合于高斯函数，并且其精确度与检测到的光子数成比例。通过将单个发射器成像并拟合到成千上万张单个图像上的子衍射限制区域，最终用户将拥有足够的数据来创建所有已识别发射器的复合重建。上面的图1说明了这种成像过程。大多数SMLM使用此通用概念进行操作，需要几乎完全相同的硬件和数据分析步骤，但在实现这种“开-关”切换行为所利用的确切荧光团化学上却有所不同。下图2给出了同一样品的宽场落射荧光和STORM的比较。

   与所有成像技术一样，STORM并非没有某些关键步骤，特别是，与其他常规技术（例如共聚焦或宽场荧光）相比，STORM被迫遵循更为严格的样品制备方案。也许最重要的是正确选择荧光团，在此进行了详细介绍。但是，尽管STORM的荧光团选择比典型情况受到更大的限制，但是在适用的情况下，它不应阻止人们追求超分辨成像的许多好处。这里提供了对STORM以及更一般的SMLM的深入讨论，重点是多通道，三维和活细胞成像方法，并特别关注了荧光团选择，标记策略和成像缓冲液配制的关键步骤。第一，将探索STORM的荧光团的特性。用于STORM和SMLM的荧光团包括合成染料，荧光蛋白（FP），甚至是量子点（QDots）。

    贴壁细胞中微管的STORM成像

   贴壁细胞中微管的STORM成像。α-微管蛋白用活化剂-报告子对Cy3-Alexa Fluor 647标记。（a）微管的宽视野图像和相应的STORM图像（c）。（b）从（a）中的方框和对应的STORM图像（d）中放大了宽场图像，显示出明显更高的分辨率

    STORM探针的属性

    光子输出

   1930年代德国物理学家Werner Heisenberg首次描述了高精度定位单个分子的概念，并在1980年代至1990年代由多个研究小组正式使用了强大的数学基础。总结他们的发现，尽管单个荧光发射器的图像显示在一个有限尺寸的光斑中，当在相机上捕获时其尺寸受到衍射的限制，但可以确定分子确切位置的精度要高得多（在如果捕获到足够多的光子，则其范围为几纳米）。这是由于以下事实：每个捕获的光子都提供独立的发射器位置测量值，该测量值与测量总数的平方根成比例。确定分子定位坐标的方法通常基于统计曲线拟合算法，以将测得的光子分布拟合为高斯函数。本练习的目的是根据等式确定光子分布的平均值（μ）和拟合位置的标准误差（不确定度σ）：

   其中s是高斯函数的标准偏差，近似于发射器的真实点扩展函数，N是从荧光分子捕获的光子数，a是成像检测器的像素大小，b是背景（包括背景荧光发射和检测器噪声）。等式（1）右侧平方根符号下的第一项考虑了光子散粒噪声，而第二项包括检测器的有限像素大小的影响。最后一项将背景噪声的影响纳入方程式。通过应用这些简单的技术，当测得的荧光团的光子分布大约为1时，可以实现大约10纳米的定位精度。与分子信号相比，000个光子和背景噪声可以忽略不计。在背景可以忽略不计的情况下，公式（1）可以近似为

   如方程式（1）和方程式（2）所述，在STORM成像中获得精确分子定位所需的高精度结果中，最关键的要素是最小化背景噪声，同时最大化荧光探针的光子输出。

   要记住的重要一点是，可以确定单个发射器位置的精确度不等于STORM重建的光学分辨率，它很大程度上取决于许多其他变量，包括漂移，标记密度等。此外，使用标准技术可能难以定量确定STORM数据的光学分辨率。然而，实际上，人们可以从高质量的STORM数据中获得大约20-50 nm的横向（x，y）光学分辨率。轴向（z）分辨率也与光子输出成比例地缩放，但还取决于3D检测方式，这将在下面进行详细介绍。在下面的图3中探讨了光子计数以及此处讨论的其他因素对STORM重建质量的影响。

    占空比

   重建单个发射器位置的基础是荧光发射曲线的时空分离。分离使得能够顺序识别发射器并将其装配到成千上万个成像帧上的子衍射受限位置。占空比是荧光团停留在“开”状态与“关”状态的时间之比。具有高占空比的探针在荧光灯“接通”状态下花费大量时间，相反，“低占空比”的探针在非荧光灯或弱荧光暗状态下花费更多时间。具有高占空比的探头很难定位，因为它们重叠的发射曲线无法准确识别单个发射器。

   应当注意的是，尽管有适度降低的定位精度和更高的计算成本，但是多种多样的多发射体拟合算法可用于识别具有部分重叠的荧光发射曲线的单个分子。尼康的N-STORM系统提供多发射器拟合作为“拟合重叠峰”分析选项。这种方法通常有意应用于活细胞STORM成像，其中时间分辨率比空间分辨率具有更高的优先级，因此在每个帧中检测到更多（和重叠）的分子以减轻运动引起的模糊。最近，针对具有大量重叠发射器的数据引入了基于反卷积的分析，从而提供了一种高性能的折衷解决方案。

    切换周期

   “转换周期”是指单个分子在永久性光漂白之前可以在黑暗和荧光状态之间循环的平均次数。在不同的探针和实验条件之间，该特性差异很大。许多探头可能只经历一个开关周期，而另一些探头可能能够进行数百或数千个周期的开关。缓冲液化学成分在确定平均开关周期数方面起着重要作用，因此最好从可信赖的配方开始并通过实验确定最佳配方。

   期望的切换周期数取决于人们希望从系统中提取的信息类型。对于定量成像应用，仅切换一次的探针可能会更好，特别是需要在荧光团与目标分子之间的化学计量比为1：1的实验中。相反，当尝试解析精细的超微结构特征（例如纳米级细胞骨架组件（例如，图2中的微管）和生物膜的组织）时，大量的切换循环可能是有利的。此外，经历多个转换周期的染料可能由于多种原因而无法定位，包括光漂白，与其他发射体重叠等。这会使定量分析复杂化，假设采用1：1标记和转换化学计量，并且在实验开始时尤其成问题，当整个集合需要在单个分子变得可识别之前被驱动到黑暗状态时。通常，合成染料比FP能够经历更多的转换周期，因为大多数FP变体由于生色团结构的不可逆改变而经历了一次转换。

    生存分数

   存活分数是在给定的照明时间后（先前已将400秒用作标准），仍然能够切换到永久被永久漂白的集合中的荧光团的比率。该数目可以与所讨论的荧光团的潜在开关循环的平均数目相关，但不总是如此。例如，在通常用于STORM的高强度照明下，荧光团可能会永久性漂白，而不会提供可用的发射事件。

   不同荧光团性质对单个分子定位图像质量的影响

   不同荧光团特性对单分子定位图像质量的影响。（a）理想的情况是，荧光团在处于开启状态时表现出低占空比，并发射大量光子，从而可以精确定位大量发射器。（b）与（a）相似，但每个发射事件的光子较少，导致定位精度较低，并且满足最低拟合标准的鉴定出的分子总数也较少。（c）具有高占空比或低对比度的探针显示出更大程度的空间重叠，从而导致更少的鉴定分子。（d）稀疏标记的样品（低定位密度）导致很少鉴定出分子。

    对比度

   在STORM成像中，背景来自天然或转染试剂诱导的自发荧光，以及来自处于弱荧光暗状态的周围探针的残留荧光。例如，处于三重态的分子仍然是弱发射体，有助于产生背景，但不能提供可用的发射曲线。因此，选择用于STORM成像的荧光探针应显示高对比度，该对比度被定义为在光激活或光转换为强发射状态之前和之后的荧光发射率。

    采样率和标签密度

   要实现常规光学显微镜的理论空间分辨率，就需要对模拟图像进行数字采样，采样频率至少应为衍射极限图像中最高空间频率的两倍，这是Nyquist-Shannon采样理论所定义的要求，也被称为奈奎斯特准则。有关空间分辨率和采样（包括Nyquist准则）的讨论，请参考我们的空间分辨率教程。

   应用Nyquist准则，必须以100 nm的增量在横向方向上最小采样具有200 nm的横向（x，y）光学分辨率的图像。通常，模拟信号的采样频率是数据中最高空间频率的2.3 – 4倍，以解决现实世界中的缺陷。对于单分子定位数据集，直接采用奈奎斯特准则的这种应用是普遍的做法。应用此定义，平均定位精度为25 nm的STORM数据需要每12.5 nm最少采样一次。但是，这是一种误导性的解释，因为STORM重建不是基于强度的图像，STORM图像中的每个点都是所识别出的发射器质心位置的概率分布。

   尽管摄像机像素大小必须足够小，以根据奈奎斯特准则对原始数据中各个发射轮廓的位置进行采样，但是可以解析基本分子分布的保真度与通常应用于显微镜数据的度量无关。从角度看，目标分子可以高精度定位（小于30 nm），但稀疏分布在样品中（相距30 nm以上）。在这种情况下，可以想像地以高精度定位每个感兴趣的分子，但不满足奈奎斯特标准。

   那么，如何确定STORM类型数据的采样质量呢？图4说明了分子采样率对于成功重建STORM图像而言，成功定位的目标分子占总分子的比例比任何任意空间采样标准都更为重要。但是，目前尚不存在一种精确的方法来估算分子采样率，该方法取决于许多因素，其中许多因素难以准确量化。此外，标本的标记是一个不完善的过程，并非每个感兴趣的分子都会被成功标记并在数据中均等地表示。因此，即使标记样品的行为也是噪声源。研究人员必须意识到定位精度和光学分辨率是不同的，并且经典的采样准则不适用于STORM数据。

   采样单分子数据

   说明如何应用空间采样率标准不足以确定STORM数据的光学分辨率。STORM的正确采样取决于分子采样率：在重建过程中定位并准确表示的感兴趣分子的真实种群比例。不幸的是，目前还没有一种准确估计分子采样率的方法。该图中所有分子的定位精度为25 nm。（a）真实单分子位置的简单一维正弦曲线图，总体分子密度相对较低（N = 116）。（b）与（a）中相同的分子位置的一维正弦曲线模式，但使用更高的分子密度（N = 464）构造。（c）通过每分辨率单位采样两次（奈奎斯特采样），尝试重建（a）中的模式。对于STORM数据，平均定位精度通常被视为分辨率单位，出于该图的目的，假定为25 nm（对于良好的STORM数据而言是保守值）。每25 nm采样两次需要在所示的500 nm范围内定位至少40个分子。（d）无法按照（c）的方法通过（b）每单位分辨率两次采样来重建较高的分子密度图。（e）每单位分辨率采样五次成功重建了（a）中的模式。（f）用（b）中较高的分子密度数据按照（e）的方法，每单位分辨率进行五次采样无法重建1D模式，这表明单个任意空间采样标准无法均匀地应用于所有STORM数据。每25 nm采样两次需要在所示的500 nm范围内定位至少40个分子。（d）无法按照（c）的方法通过（b）每单位分辨率两次采样来重建较高的分子密度图。（e）每单位分辨率采样五次成功重建了（a）中的模式。（f）用（b）中较高的分子密度数据按照（e）的方法，每单位分辨率进行五次采样无法重建1D模式，这表明单个任意空间采样标准无法均匀地应用于所有STORM数据。每25 nm采样两次需要在所示的500 nm范围内定位至少40个分子。（d）无法按照（c）的方法通过（b）每单位分辨率两次采样来重建较高的分子密度图。（e）每单位分辨率采样五次成功重建了（a）中的模式。（f）用（b）中较高的分子密度数据按照（e）的方法，每单位分辨率进行五次采样无法重建1D模式，这表明单个任意空间采样标准无法均匀地应用于所有STORM数据。（e）每单位分辨率采样五次成功重建了（a）中的模式。（f）用（b）中较高的分子密度数据按照（e）的方法，每单位分辨率进行五次采样无法重建1D模式，这表明单个任意空间采样标准无法均匀地应用于所有STORM数据。（e）每单位分辨率采样五次成功重建了（a）中的模式。（f）用（b）中较高的分子密度数据按照（e）的方法，每单位分辨率进行五次采样无法重建1D模式，这表明单个任意空间采样标准无法均匀地应用于所有STORM数据。

   建立精确的STORM重建所需的必不可少的高采样率直接转化为需要尽可能密集地标记样品的需求；理想情况下，应该对每个感兴趣的分子进行标记，以最大程度地提高分子采样率。还必须确定目标分子和所选荧光标记之间的适当化学计量。请记住，可以标记样品太致密–淬火效果，聚集和其他类似的施加限制了实际的标记密度。一如既往，最佳条件应通过实验确定。

   同样，应该认识到如何标记感兴趣的目标。许多STORM探针（例如Alexa Fluor 647）都带电，因此无法有效穿过质膜，因此很难在生物系统中应用。另外，许多标记系统（例如抗体）太大而无法通过质膜和/或它们的进入受到细胞环境内空间位阻的限制。尽管Alexa Fluor 647仍可用于活细胞成像，但它仍然受到限制，需要额外的时间，人工和破坏性技术（例如显微注射或电穿孔）才能引入细胞。但是，可以使用标准的免疫细胞化学技术和试剂使固定细胞通透。

    选择探头的其他注意事项

   探头选择的一个经常被忽视的方面是成像激光功率。大多数合成染料的关闭开关速率与成像激光功率大致成正比：更高功率的激光照明可以更快地将发射器切换到暗态（并且还可以加快光漂白速率）。要确保大多数荧光团在任何给定时间处于暗状态，都需要很高的激光功率，特别是对于标记密集的样品。此外，即使染料具有低占空比，某些染料仅需要比其他染料更高的功率密度来实现截止切换。

   用于生物成像的大多数高质量（甚至“高功率”）激光器不能提供足够的功率密度来诱导大多数荧光团的光开关。还必须注意不要使用过多的功率。通常，尽管某些系统（例如N-STORM）可能会提供附加的光束放大光学器件，但成像光纤在光纤上的额定功率至少应为200 mW，从而帮助一个光学系统达到必要的功率密度，从而在较困难的探头中引发开关行为。请记住，即使使用类似的荧光团，切换动力学也会有很大差异，并且不一定总是需要高激光功率。尤其是荧光蛋白，可以以较低的功率密度有效切换。

   未结合的染料和过量的染料会（通常会显着）对背景产生影响，从而降低单个发射器发出的信号并导致定位精度降低。在许多情况下，背景信号将完全无法进行STORM成像（对于较厚的样本尤其如此）。对于活细胞STORM，它有助于使探针具有荧光性：当探针与目标结构结合后，荧光显着增加，从而减轻了未结合染料的检测。

   在这里探讨的每个类别中，没有一个探针能达到理想的效果，真正的挑战是确定这些因素中的哪些因素为实验需求提供了折中的余地。

    多通道STORM成像

   荧光显微镜的主要优点之一是能够对标有更多种荧光团类型的标本进行成像，以生成具有两个或多个通道的图像，以帮助阐明感兴趣的生物结构或分子之间的相对组织和相互作用。在两个或多个荧光探针占据相似体积的情况下，可以对其进行共定位分析以确定它们的相对重叠，从而获得有关潜在的体内分子相互作用的信息。单分子数据的共定位分析本质上比对衍射极限数据进行的定位更准确。

   碳花青活化剂-报告染料对的光开关特性和分子结构

   碳花青活化剂-报告染料对的光开关特性和分子结构。这些荧光团的光谱不同组合表现出光开关行为，如（a）所示，其中下图突出显示了三种可光开关报告分子的荧光时间轨迹：Cy5（黄色线），Cy5.5（橙色线）和Cy7（红色线） ）。每种染料都与Cy3单元配对作为活化剂染料。（a）中的上面板描绘了用于激活报告染料的绿色激光脉冲（532纳米）。远红外激光（657纳米）不断照亮标本，以激发报告分子发出的荧光并将其切换回暗态。（b）中显示了花菁报告分子和活化剂荧光团的分子结构，以证明这些探针的相似性。

   STORM最初使用一对橙色和红色发光的花青染料Cy3和Cy5进行开发，结合形成所谓的激活剂-报告剂对，或更通俗地说是“染料对”。实际上，在Cy3的辅助下，Cy5可以以可控和可逆的方式在荧光状态和暗状态之间切换（图5）。用红色激光（〜647 nm）激发可以激发Cy5发出的荧光，也可以将染料切换为暗态。Cy3的激发导致能量向Cy5的非辐射转移，从而刺激其从黑暗状态恢复，这一过程称为激活。。在许多情况下，报告分子的活化可以用高能激光完成，而无需借助近端活化剂染料。Cy3-Cy5激活剂-报告剂对具有极佳的疲劳率，因为在永久性光漂白之前，Cy5可以打开和关闭数百次。该染料对用于标记短的双链DNA分子，每对被明确定义的碱基对隔开，STORM用于高精度分辨相邻染料对之间的距离。

   荧光多色成像的基础是确定可同时应用于样品的几种光学上可区分的探针的要求。在STORM中，可能有许多激活子-报告子对，每个对都由读出荧光的报告子探针和促进报告子恢复为荧光状态的激活子探针组成（例如，上例中的Cy3），如图5所示。例如，通过三个具有不同发射波长的报告荧光团和三个具有不同吸收光谱的活化剂荧光团（例如Alexa Fluor 405，Cy2和Cy3）的组合配对，最多可以形成九个可区分的探针。

   此策略在STORM中用于首次多色成像演示，该演示使用固定在表面的DNA分子进行，并对标记有微管和网格蛋白涂层的凹坑的免疫荧光标本进行了双色成像。使用单一报告染料的主要优点是，由于本地化来自具有相同光学特性的荧光团，因此各个通道是对齐的。但是，这种方法经常遭受高水平的通道间串扰。同样，染料对标记的抗体也不市售，必须“内部”产生。图6提供了使用染料对方法获取的示例图像。

   使用STORM的双色超高分辨率成像

   STORM成像的微管和线粒体标记有激活剂-报告子对。在宽场荧光（a，b）和风暴（c）中捕获了两通道图像。该标本是用染料对Alexa Fluor 405和Cy5对线粒体（洋红色）进行染料免疫染色的附着的非洲绿猴肾细胞的固定制剂，对Alexa Fluor 488和Cy5进行了染色以突出微管网络（绿色）。在图像采集期间，使用405纳米和532纳米激光脉冲的交替序列依次激活每一对。使用657 nm激光读取记者荧光。在（b）中扩大了广角图像（a）中的白框，以便与（c）中的相应STORM图像进行比较。

   STORM使用不带活化剂染料的光谱不同的报告染料进行广泛执行，该技术最初被称为直接STORM（dSTORM）。光谱不同的探针的使用允许用户简单地应用市售的荧光团和标记试剂。这种方法的缺点是不同的报告荧光团通常具有不同的缓冲液要求。同样，色差将导致不同波长的光聚焦在不同点上。这通常在衍射限制方案中并不十分关键，但是在纳米级，位移可能非常显着。但是，可以通过获取多色亚分辨率荧光珠的校准图像进行后续翘曲校正操作来对此进行校正。另一种方法是使用由单个激光线激发的高性能但光谱相似的染料，并使用二向色镜将发射光分成两个不同的检测器（或单个相机芯片的两个部分）。

   通过组合光谱分离的合成染料和FP作为标记，也可以实现多色超分辨率成像。事实证明，仅使用FP进行多色成像会更加困难，因为一个FP的激活前状态的发射光谱通常与另一个FP的激活后状态的发射光谱重叠，这是因为FP的吸收光谱和发射光谱分布非常广泛。用FP进行双色成像的第一个演示是将暗绿色FP Dronpa与绿色到红色光可转换FP tdEos结合在一起，分别标记固定细胞中的肌动蛋白和粘着斑。依次对两个荧光团成像，首先对tdEos成像，然后在所有tdEos分子均被转化/光漂白后对Dronpa成像。不幸，

    三维STORM成像

   将STORM成像扩展到三维是该技术的重要早期发展。不幸的是，当聚焦在单个2D平面上时，很难获得关于荧光团轴向位置的准确信息-考虑到STORM中的开-关切换速度会阻止在任何单个发射事件中采集z烟囱，所以这是必要的适用于传统的3D光学显微镜。作为响应，针对3D STORM成像已发展出许多策略，包括同时在两个或多个不同焦平面中成像，干涉测量，倾斜镜以及点扩展函数傅里叶变换与更复杂的数学模型（例如双螺旋点扩展函数）使用空间光调制器。

   最简单和最直接的技术之一是根据单个发射器图像中存在的像散，根据z深度确定荧光团的轴向位置。这种方法最初是作为使用STORM进行三维成像的辅助系统而开发的，需要在发射路径中添加一个弱圆柱透镜。每个荧光团图像的椭圆度成为其距焦平面距离的高度敏感度量，而图像的质心用于定位横向（x，y）位置。

   尼康的N-STORM系统利用庄小伟实验室的像散方法进行3D STORM成像，在大约1微米（μm）的范围内产生大约50-90 nm的轴向分辨率，而在4+μm的范围内N-STORM 4.0通过使用专有的焦点偏移机制来执行z步进。图7探索了使用散光方法进行3D STORM成像的原理。

   贴壁细胞中微管的三维（3D）STORM图像。（a）用Alexa Fluor 647对α-微管蛋白染色的BSC-1细胞的3D STORM图像，并使用Nikon N-STORM 4.0系统获取。左侧的条提供了以微米（μm）为单位的z位置，对应于图像中的每种颜色。（b）对应于（a）中白框的感兴趣区域放大了。（c）该图说明了尼康N-STORM系统应用的3D STORM原理。简而言之，圆柱透镜会引入像散，导致单个发射器的图像沿z位置的函数沿x或y方向拉伸。（c）中的绿色和蓝色线对此进行了说明，该图显示了由于弱柱面透镜而导致光线在x和y方向上的聚焦方式不同。拉伸幅度和方向与校准文件的相关性使得可以高精度确定z位置。

   STORM类型3D成像的替代方法利用了同时进行多焦平面成像的优势。通过同时对样本中的两个（或多个）焦平面成像，可以分析激活的荧光团的图像（一个过度聚焦和一个聚焦不足），以适应三维点扩散函数。光斑尺寸的比率是轴向位置的单调函数，因此可以进行定量评估。这种技术被称为双平面轴向定位显微技术，无需扫描即可在z方向成像约800纳米，借助轴向扫描技术可成像几微米。双平面成像的主要优点之一是图像的横向分辨率与轴向位置无关。最新的多焦点方法使用专用衍射光栅将9个不同的z平面同时成像到同一相机芯片上。这种方法允许用户在单次相机曝光中捕获发射器的全部点扩展功能，但信号会略有减少。

   3D STORM也可以使用具有空间光调制器的宽视场显微镜来实现，以产生双螺旋（或其他结构化）的点扩展功能。仪器配置为包括所谓的4 f检测路径中的图像处理部分，旨在将标准显微镜点扩展功能（从单分子发射器产生）与空间光调制器生成的双螺旋点扩展功能进行卷积。通过将标准显微镜图像的傅立叶变换乘以专用点扩展函数（仅相位函数）的傅立叶变换，可以在共轭孔径平面中执行该卷积。单个发射器的最终点扩展函数包含两个主要波瓣，这些波瓣的角度方向与发射器的轴向位置相关。通过创建校准曲线，可以以大约20纳米（标准偏差）的精度并在接近2μm的范围内确定荧光团的轴向位置（焦平面上方或下方）。

   迄今为止，使用干涉术进行了3D单分子定位成像的最高（轴向）分辨率演示。该方法被称为iPALM，能够在轴向上实现大约10纳米的分辨率，在横向上实现大约20纳米的分辨率。干涉测量法用于测量样品与分束器重组后所发射的单个光子在两个与位置有关的路径（两个直径相对的成像物镜）中的差异，以便光子可以自干涉。iPALM的最关键方面包括相干性要求，严格的仪器校准以及对荧光波动性质的耐受性，这些条件是使用专用的多相分束器满足的。另外，成像（z）深度被限制为大约200纳米。iPALM已用于解决膜，粘着斑，微管和内质网的轴向尺寸。不幸的是，目前iPALM尚无商业实现，并且仪器的复杂性（以及严格的校准程序）可能会限制其广泛应用。其他（非干涉式）双重目标方法也已得到验证。

    活细胞STORM成像

   进行时间分辨的活细胞和组织图像序列捕获的能力是荧光显微镜的标志之一，并且几乎可以通过任何对比或光学切片模式实现。尽管时间分辨成像的单分子方法受到限制，但仍出现了一些进展，这些进展表明了使用这些方法进行未来时间研究的希望。

   通常认为STORM类型的超分辨率技术太慢，不足以对活细胞成像有价值，因为单个重建通常需要成千上万个单独的图像数据帧。但是，几项研究成功地证明了多个目标的时间分辨STORM成像具有最小的运动诱发模糊。单粒子跟踪PALM（sptPALM）代表了具有纳米级空间精度的活细胞中单粒子跟踪的普遍性，单光跟踪PALM（sptPALM）体现了这一点，在许多场合下都使用光学荧光笔FP来跟踪多达数千个蛋白质分子的运动。同时在一个和两个颜色的实验中，从粒子轨迹中获得有关底层细胞动力学的高分辨率信息。

   具有单分子超高分辨率的活细胞成像

   在粘附的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中，tdEos的时间分辨单分子成像与粘着斑蛋白paxillin融合。（af）白色，黄色和青色箭头突出显示了随时间变化（1105秒）观察到的单个粘附复合物的相互作用和伸长。在宽视野荧光中看不到新生的粘连，并且在宽视野中看起来均匀的特征以其真实大小显示，内部细节明显更多

   活细胞中SMLM的第一个证明之一是使用光可转换的荧光蛋白tdEos解决了粘着斑复合体动力学。以25-60秒/图像的帧速率获得了约60纳米的横向分辨率的视频，成功捕获了粘连的逆行传输和伸长。该数据显示在上面的图8中。

   还已经证明了使用合成染料代替FP的活细胞STORM。该技术依赖于天然存在的含硫醇的试剂谷胱甘肽的存在，其以毫摩尔浓度存在于动物细胞中。这种方法的一个例子是将靶标特异性小分子染料（例如MitoTracker Red，LysoTracker Red）用于活细胞STORM。表1中包含用于STORM的结构特定的小分子染料，供读者参考。但是，此类染料通常是亲脂的，因此不靶向任何特定的分子种类（例如目标蛋白质）。先进的混合标记技术，例如SNAP和HALO标签系统，已经成功地用于活细胞STORM成像。

   高量子效率和低象素依赖性噪声的科学互补金属氧化物半导体（sCMOS）检测器的应用使STORM数据的采集速度比以前使用慢速读取电子倍增电荷耦合器件（EM-CCD）可能获得的速率高得多。 。较早的基于EM-CCD的STORM / SMLM系统限于每秒30帧（fps），而现代sCMOS相机则允许以超过1000 fps的速度采集STORM帧，具体取决于型号和感兴趣区域的大小（较小的区域为读出更快）。该方法的主要局限性在于大多数荧光团的导通时间为数十毫秒（ms），因此在单个ms范围内的采集会将来自单个分子的信号分配到多个帧中，从而有效降低了每个荧光团的潜在定位精度发射器并且在给定时间范围内可以定位的独特分子数量方面的收益递减。仍然，sCMOS相机结合了多发射器拟合算法（允许用户最大化每个帧中的分子数量）和融合到许多不同目标的FP，实现了视频速率STORM（每秒30次重构）。

    STORM成像探头

   在多个结构族中发现了适用于STORM的合成染料，主要是花青和若丹明衍生物，还有恶嗪等。一般准则是，更多的红移STORM染料比蓝移的染料表现更好。在讨论STORM的合成染料分子时，我们将讨论荧光染料光化学，STORM缓冲系统及其作用机理的相关方面，最后讨论按光谱类别组织的STORM特定染料的用途。

    荧光染料光化学

   用于STORM显微镜的荧光染料家族。（a）an吨形成许多染料家族的结构基础，包括荧光素，曙红和若丹明衍生物。（b）Cy5的化学结构，一种与Alexa Fluor 647密切相关的花青染料，其pi共轭体系以红色突出显示。单键和双键交替的聚次甲基桥连接左手环系统和右手环系统。（c）ATTO 655的化学结构，一种用于STORM的恶嗪染料，带有pi共轭体系，突出显示为红色。（d）四甲基若丹明的化学结构（缩写为TAMRA或TMR），一种罗丹明染料，已被证明可用于STORM成像，其pi共轭环系统以红色突出显示。

   现代荧光显微镜的许多合成染料是are吨衍生物（x吨的化学结构如图9所示）。在所有的荧光素，曙红和若丹明染料中都发现了基本的x吨核心结构，仅在所连接的官能团上有所不同，因此具有许多共同的光化学特性。此处讨论的另一个主要家族是花青染料，其特征在于长的多甲亚氨酸桥（-CH基团具有交替的单键和双键，图9），在桥的一侧或两侧连接了含氮官能团。

   扩展的π共轭体系使来自吸收的光子的能量离域化-稳定了电子跃迁，从而允许吸收更长波长（更低能量）的光。不同的官能团和其他结构差异使每种染料具有各自独特的光化学特性，包括在许多情况下将染料转换为非荧光暗态的能力。图9说明了几种常见染料的化学结构，每种染料的荧光pi共轭体系通过其代表性的发射波长颜色突出显示。

   图10提供了简化的Jablonski图，该图说明了STORM的假设荧光团感兴趣的电子能态。单重态电子基态S 0是最低可用能级。注意，每个电子能级具有多个紧密间隔的振动能级。荧光团可以被激发或弛豫到给定电子态的许多不同振动能级，从而导致大多数荧光团的吸收（激发）和发射光谱相对较宽。第一激发电子态S 1选自S达到0时吸收能量等于s之间的差0和S 1。通常在吸收光子能量之后进行一定程度的振动弛豫和内部转换过程，随后释放以荧光光子形式的剩余能量，从而使荧光团弛豫到基态S 0。荧光主要发生在从S 1到S 0的跃迁中，高于S 1的电子能量状态几乎完全是通过振动弛豫和内部转换而弛豫。出于我们的目的，重要的是，荧光团可以从S 1状态发生系统间交叉，到达第一激发三重态T 1（亚稳态和弱荧光状态）。

   形成稳定染料自由基的简化Jablonski

   简化的Jablonski图，显示了用于假设荧光团的STORM类型成像的各种荧光和非荧光状态。（a）S 0基态是可用的最低能级，并且包含一对自旋相反的电子，因此满足保利排斥原理。（b）来自S 0的电子可以通过吸收光子而激发到S 1状态，并在S 0中保持其伴侣的相反自旋。（c）然后，S 1电子可以经历系统间转换，进入弱荧光三重态T 1，通过反转其自旋，可以有效地使电子与其基态伙伴配对。被称为“禁止的”自旋跃迁，这通常是分子弛豫最慢的形式之一。T 1中的分子通常（通过非辐射弛豫或磷光途径）弛豫至S 0或经历系统间交叉而进入不同状态。（d）减少许多处于T 1状态的荧光团，会产生一个暗淡，寿命长且稳定的自由基状态（R.），这对于STORM成像很重要。（e）另外，某些染料（例如恶嗪）可以完全还原形成无色隐色染料（RH），并且使用寿命长。T 1，R。和RH状态被分子氧淬灭，这通常是使用酶促氧清除系统从分子氧中去除的

   正是从三重态开始，许多荧光团可以还原为非常适合STORM成像的深色和稳定的自由基状态。请注意，某些荧光团可以替代地被氧化形成深色稳定的阳离子物质（这是罗斯明染料MitoTracker Red提出的闪烁机制）。取决于荧光团和缓冲液的组成，暗态寿命可以从几秒到几小时不等，为了获得STORM的低占空比，需要更长的寿命。用于STORM的大多数若丹明和恶嗪染料都被还原形成暗自由基，通过荧光团的pi共轭体系中多余电子的离域来稳定。

   还原剂通常是伯硫醇，最常见的是β-巯基乙醇（BME）和/或巯基乙胺（MEA），尽管已经探索了许多替代方法。还原的若丹明和恶嗪染料相对没有反应性，但是在400 nm左右有很强的吸收能力，可以利用这种特性将荧光团带回到S 0基态。405 nm（或类似波长）的激活激光器通常集成在STORM成像平台（包括N-STORM）中，以便更好地控制眨眼程度。

   氧化物质（例如三重态氧）会淬灭三重态并还原染料状态，在此过程中产生有害的活性氧（ROS）。三重态和自由基状态的长寿命对于STORM成像至关重要，由于重要官能团的不可逆氧化损伤，淬灭会导致更高的占空比和更高的光漂白速率。因此，STORM缓冲液配方中通常包括除氧系统，从而降低了有效占空比并减少了光漂白。葡萄糖氧化酶是STORM最常用的除氧剂，尽管已经引入了几种类似的具有较大长期pH稳定性的系统，并将对此进行讨论。

   图11 - Cy5和Alexa Fluor 647的光开关机制

   Cy5 / Alexa Fluor 647使用两种通常用于STORM的不同还原剂的光开关机理的简化图示。（a）TCEP通过破坏pi共轭体系（以红色突出显示）与染料形成非荧光加合物。可以使用高能紫外紫光（405 nm）来破坏键，从而恢复负责荧光的pi共轭体系。（b）向（a）中相似，伯硫醇的应用（RS-）和较长的波长成像在形成非荧光加合物，其可与较高能量UV-紫光随后被折断的光的结果。

   已证明使用标准STORM缓冲液的Cy5，Alexa Fluor 647和Cy7的眨眼机制至少部分是由于染料与伯硫醇之间光诱导形成的非荧光加合物。硫醇的结合中断了染料的pi共轭体系，从而诱导了暗态，如上图11（a）所示。硫醇加合物在紫外-紫罗兰色范围内吸收很强，该特性可用于破坏键，恢复染料的pi共轭体系（类似于罗丹明衍生物的紫外-紫罗兰色活化）。还原剂三（2-羧乙基）膦（TCEP）与Cy5 / Alexa Fluor 647形成非荧光加合物，可被UV-紫罗兰色光破坏（图11（b））。

   Atto 655和Atto 680均为恶嗪染料，均经过STORM成像验证。Atto 655的光开关类似于若丹明染料，但是重要的是，该染料的自由基阴离子状态可以进一步还原，以形成无色的无色染料，如图10中的Jablonski图所示。无色染料非常稳定，但与其他黑暗状态一样，完全还原的无色形式可以通过分子氧淬灭。Atto 655的占空比异常低，在类似条件下与Alexa Fluor 647的占空比大致匹配。

   最近，Stefan Hell（由Abberior GmbH商业化）的实验室引入了一系列染料，这些染料无需特殊的缓冲液成分即可诱导转换，特别是无需还原和氧化系统或除氧剂。这些染料是笼状罗丹明螺酰胺（RSAs），图12说明了它们的一般光开关机理。RSA最初处于非荧光笼状（对应于闭环结构），并通过UV-紫色激活光（例如405 nm）或通过高强度成像光解笼/激活为荧光状态（开环）。未封闭的荧光形式在毫秒内热松弛为笼状的非荧光形式。这些染料不需要外来化学添加剂，但在极性溶剂中的性能最佳

   图12-笼中若丹明螺酰胺的开环和闭环

   笼状若丹明螺酰胺（RSAs）的开环和闭环。（a）非荧光笼状，其中π-共轭体系以闭环形式被破坏。高能紫外线紫罗兰色会引起开环。（b）荧光未封闭的形式，开环结构允许完成pi共轭环系统（以红色突出显示）。该形式可热恢复为笼状，而无需外来添加切换剂或额外的照明。FLIP-565是可从Abberior GmbH商购的RSA。

   缓冲系统

   荧光团的光化学决定了STORM缓冲系统的选择。在过去的十年中，STORM缓冲液化学和几种新的替代配方得到了逐步改进。STORM缓冲系统的“基础”通常是研究人员选择的生理缓冲液。大多数已发布的系统都使用Tris，但这是由于其作为生理缓冲剂的更普遍的有效性。缓冲对于保持pH稳定性非常重要，大多数荧光团对pH值非常敏感，在非最佳pH值下很容易损害其性能。三是受欢迎，因为它的pKa一个在室温下接近8.0，可有效缓冲7.5-9.0之间的pH。还显示出它可以稍微增加膜的渗透性。通常，由于STORM成像的碱性较低（〜8.0），与葡萄糖氧化酶的作用相关的pH下降，因此优选。

   大多数STORM缓冲液配方都包含除氧系统。如所讨论的，分子氧起三重态和自由基态猝灭剂的作用，缩短了暗态寿命并产生了ROS，这与常见的光漂白途径有关。由于这些原因，应用了酶促除氧系统，最常见的是“ GLOX”系统。GLOX由葡萄糖氧化酶组成：一种从黑曲霉菌中提取的氧化还原酶，它通过分子氧催化葡萄糖的氧化，生成葡萄糖酸内酯和过氧化氢，如式3所示。这是除氧的机理，请注意，它需要向缓冲液中添加过量的葡萄糖以驱动反应。

1 β-D-葡萄糖 + 1 O₂ 

→ 1 D-葡萄糖酸-1,5-内酯 + H₂O₂ (葡萄糖氧化酶)

2 H₂O₂ → 2 H₂O + O₂ (过氧化氢酶)

   葡萄糖氧化酶产生过氧化氢是有问题的，因为它也是有害的ROS。为了解决这个问题，GLOX制剂中包括过氧化氢酶，如上式4所述，催化过氧化氢分解为水和氧气。尽管此反应会产生氧气，但如方程式3和4所示，净氧气将从系统中除去。

   尽管GLOX系统继续作为STORM成像的便捷标准，但其使用仍存在一些问题，特别是对于更长的成像实验以及与罗丹明衍生物一起使用时，若与较高的稳态氧浓度相比，罗丹明衍生物的闪烁效果更好。应用GLOX时仍保留。随着时间的流逝，基于GLOX的系统的pH值将变得越来越酸性，因为葡糖酸内酯被水解为葡萄糖酸，其pK a为3.86。这可能会带来很大的困难，因为荧光团的分子跃迁高度依赖于pH值，并且眨眼通常在弱碱性pH值下是最佳的。然而，已经彻底探索了替代的，可行的且pH稳定的除氧系统。

   吡喃糖氧化酶类似于葡萄糖氧化酶，但催化葡萄糖氧化为酮2-酮-D-葡萄糖（一种不会显着影响pH的产物），如以下等式5所述。与葡萄糖氧化酶一样，吡喃糖氧化酶也与过氧化氢酶（等式6）和葡萄糖结合使用，形成“ POC”系统。包括过氧化氢酶是因为在反应中仍会形成ROS过氧化氢。POC系统是STORM的GLOX的可行且pH稳定的替代品，但价格也更高。

D-葡萄糖 + O₂ ⇌ 2-酮-D-葡萄糖 + H₂O₂ (吡喃糖氧化酶)

2 H₂O₂ → 2 H₂O + O₂ (过氧化氢酶)

   另一个成熟的除氧系统是原儿茶酸-3,4-二加氧酶（PCD）及其底物原儿茶酸（PCA）的组合。PCD催化由PCA和分子氧形成3,3-羧基-顺，顺-粘康酸。尽管形成羧酸作为反应产物，但PCD / PCA系统的pH值仍比GLOX稳定（但低于POC）。有趣的是，与GLOX相比，PCD/PCA系统保持的分子氧稳态浓度低约5倍。

   最近，为多色STORM引入了“ OxEA”缓冲液，并被证明可以在比典型的激光功率低的情况下有效地将若丹明衍生物转换为暗态。OxEA缓冲液利用OxyFluor™，这是一种可从Oxyrase Inc.购得的大肠杆菌的耗氧膜级分。OxyFluor™的底物是DL-乳酸盐。与GLOX和同类缓冲剂相比，对于花菁染料，OxEA缓冲剂的性能受到极大限制，这可能是由于较高的稳态氧浓度所致。

   典型的STORM缓冲液配方中的最终成分是伯硫醇或其他合适的还原剂。除了MEA和BME外，其他的还原剂还包括硫醇二硫苏糖醇，谷胱甘肽和其他（尽管尚未对STORM进行广泛测试）。通常以10-200mM的浓度施用硫醇。硫醇充当电子供体，有助于形成长寿命的阴离子暗态，如先前提供的Jablonski图所示（图10）。请记住，与花青衍生物一起，硫醇会与染料形成非荧光加合物，随后可通过紫外线-紫罗兰色照射将其破坏（图11）。硫醇也可以用作弱三重态淬灭剂。

   还原剂TCEP通过将1,4-加成到聚次甲基桥上而与染料形成非荧光共价加合物来可逆地淬灭Cy5，Cy7和其他相关染料中的荧光（图11），与主要的硫醇MEA和BME。除TCEP外，还包括酶促除氧系统（例如GLOX），抗坏血酸和甲基紫精，以最大程度地减少瞬时眨眼和漂白行为。表1中提供了TCEP缓冲液的确切配方，以及许多用于各种荧光团的常见STORM缓冲液配方。

   表1-用于STORM成像的不同有机染料和荧光蛋白的比较

   表2中详细描述了每个探针列出的缓冲液。为简单起见，并非所有推荐的缓冲液都按照探针提供的参考文献中给出的公式给出，在这种情况下，参考文献未在括号旁边用括号括起来。对于具有多个种类的探针，列出了多个激发和发射最大值：（B）=蓝色种类，（C）=青色种类，（G）=绿色种类，（R）=红色种类。

   表2 - STORM成像缓冲液

   表1列出了特定荧光团的缓冲液配方。请注意,此表未考虑pH值。pH和缓冲剂浓度应通过实验优化以找到最佳的工作溶液

   STORM的最佳合成染料

   超分辨率的格局在不断变化，我们期望对可用探针，缓冲系统的改进以及对基本光化学的了解将继续导致改进探针和标记选项，从而为STORM成像开辟新的研究途径。因此，在撰写本文时，该清单不应被视为绝对清单，而应视为每个光谱类别中当前最佳可用荧光团的实用快照。

   紫外线蓝染料

   从紫外到青色光谱区域发射的探针通常不适合STORM成像。尽管尚未完全探究确切原因，但已表明，激发该区域中的探针所需的高能量光，加上诱导开关通常所需的高强度，与激发相比，迅速导致更大程度的光损伤消光系数高且能量较低的红移荧光团的制备。

   但是，据报道，核染色剂DAPI，Hoechst 33342，Hoechst 33258和Vybrant DyeCycle紫罗兰色都可以用于固定细胞中DNA的STORM成像。据推测，这些染料可以被紫外线紫光去质子化，从而导致光转换为具有红移激发和发射光谱的物质。使用蓝色（488或491 nm型）激光读出和使用405 nm激光线激活已证明了这些核染料的光开关。尽管检测到的光在技术上不属于UV-Cyan光谱范围内，但这确实代表了使用常用的染色试剂对染色质进行STORM成像的潜在强大而简单的方法。这些染料的STORM成像确实需要一种更专门的STORM缓冲液，该缓冲液主要由甘油组成。

   绿黄色染料

   尽管对于STORM，绿色荧光染料的性能通常不如许多流行的红色荧光染料好，但它们仍然与领先的远红色染料（Alexa Fluor 647）结合用于多色成像实验。红色染料与远红色或绿色染料的共同成像会导致严重的渗色（取决于显微镜的配置），如果不加以适当考虑，会使分析复杂化，并损害分离度和特异性。多色STORM成像通常使用多带通滤波器顺序执行，因此串扰可能很明显。

   目前，用于STORM成像的性能最好的绿色染料是ATTO 488和Alexa Fluor 488，这是一对结构相似的若丹明衍生物。应当指出，STORM成像，特别是蓝移若丹明衍生物的成像，通常需要强大的激光照射。对于ATTO 488和Alexa Fluor 488，这都是正确的，因为在标准缓冲区中，它们没有像红移的对手那样容易地切换到黑暗状态。额定功率低于100-200 mW的488 nm激光器通常不合适，因为它们提供的强度不足，无法将足够多的整体驱动至暗状态，从而无法可靠地识别单个发射器。

   如果将SNAP标签或CLIP标签标记系统用于活细胞成像，这将在后面讨论，那么一种选择是Oregon Green，它可以从New England Biolabs Inc.（NEB）获得适当功能化的形式。重要的是，这种染料得益于活细胞中还原剂谷胱甘肽的天然存在，其浓度约为5-10 uM，具体取决于细胞类型，隔室等。这排除了向STORM中添加外源硫醇或其他还原剂的需要。缓冲液，可能会损害标本的自然生理。仍可以包括除氧系统以获得最佳效果，但并非严格要求。

   通过将笼罩染料置于非荧光状态，可以改善许多染料的光子统计，有效地降低了占空比，因为在成像之前无需将笼状染料驱动到暗态。这种方法有助于减少初始光漂白，从而允许更高的有效标记密度，这对于适当采样目标结构很重要。请注意，这种笼养方法也已应用于多种用于固定细胞STORM成像的若丹明和花青染料，包括ATTO 488，并且在某些情况下将平均光子输出提高了几个数量级。但是请注意，笼状染料通常仅经历一个转换周期。

   橙红色染料

   对于STORM，性能最高的红色染料是Cy3B。但是，使用Alexa Fluor 568或Alexa Fluor 555通常更方便，因为它们的性能与Cy3B相似，并且更容易从各种商业渠道以预结合形式获得。Cy3B可以官能化的NHS酯，马来酰亚胺或游离酸的形式从GE Healthcare（General Electric Company）获得。然而，据我们所知，它不能从任何预先与常见标记分子（例如抗体）结合的商业来源获得。

   对于活细胞成像，已显示TMR Star（NEB）使用SNAP标签和相关系统（例如CLIP标签，HALO标签等）适用于STORM。与505-Star一样，通过在标记之前使用硼氢化钠将染料在黑暗状态下笼罩，可以增强TMR Star的活细胞性能。几种流行的用于不同细胞器活细胞STORM成像的亲脂膜染料都在此光谱范围内，包括MitoTracker Red，DiI，LysoTracker Red，ER-Tracker Red等。荧光和亲脂性污渍的进一步发展目前是一个具有极大研究兴趣的话题。

   Abberior提供了FLIP 565，这是一种RSA，它可以经历数个开关周期，并由UV-紫罗兰色光激活并热松弛至非荧光状态，荧光寿命在几毫秒的范围内。已证明使用尼康N-STORM系统对FLIP 565进行STORM成像。

   远红染料

   毫无疑问，Alexa Fluor 647仍然是STORM / SMLM的最高性能探针。Alexa Fluor 647在典型的STORM缓冲条件下每周期发射约6000个光子，具有非常低的占空比，经历了许多开关周期，在各种成像条件下均得到了很好的验证，并且可以很容易地从与各种标记试剂。Cy5在结构上与Alexa Fluor 647非常相似，但一般首选Alexa Fluor 647，部分原因是Cy5对臭氧降解的敏感性高。除了用于STORM成像的Alexa Fluor 647和Cy5外，还存在许多远红染料，但通常与STORM的性能不匹配。

   一种新型的若丹明（SiR）远红外发光染料可作为苄基鸟嘌呤共轭物用于SNAP-标记647-SiR的SNAP标签（NEB）。与Alexa Fluor 647和Cy5不同，SiR具有细胞渗透性，可用于通过SNAP标签系统进行活细胞成像。尽管SiR不需要专用的STORM缓冲区，但其STORM的性能在一定程度上受到其相对较低的光子输出和中等占空比特性的限制。最近，引入了具有改进的开关和光子输出的HMSiR。

   活细胞STORM可以用多种远红色的亲脂性和/或细胞器特异性染料进行，包括MitoTracker深红色和DiD。对于某些应用，ATTO 655是一种受欢迎的远红选择，因为它是一种恶嗪染料，可以在很长一段时间内以稳定和无色的无色形式搁置，导致低占空比。已针对活细胞中的甲氧苄啶（TMP）标签结合STORM进行了证明（类似于SNAP标签类型系统）。不幸的是，ATTO 655的光子输出较低（每个开关约700个光子），限制了其在STORM中的效用。

   近红外染料

   对于STORM成像，可能难以实现近红外（NIR）染料，但是与可见光谱其他部分的荧光团相比，使用专用的STORM缓冲液和成像方案，它们的性能最接近最佳的远红染料。使用前面所述的基于TCEP的缓冲系统，Alexa Fluor 750的每个发射事件平均显示约2800个光子（相比之下，没有TCEP的每个开关约500个光子）。此外，Alexa Fluor 647在TCEP缓冲系统中每个发射器的平均光子计数仍超过3000，与基于GLOX /硫醇的缓冲系统相比有所降低，但在使用具有相似精度的Alexa Fluor 750进行两次彩色成像时具有很大的实用性。应该注意的是，对于典型的GLOX /硫醇缓冲液，NIR染料（例如Alexa Fluor 700，Alexa Fluor 750，

   与近红外染料成像相关的主要困难之一是激发激光。高质量的高功率700+ nm激光器价格昂贵，并且比可见波长激光器更难集成到成像平台中。因此，可能需要一段时间才能将此类NIR激光器广泛用于SMLM和/或STORM的交钥匙系统。请注意，还已知750 nm气体激光器会引起样品中的分子振动，从而有效降低定位精度。使用近红外激发很难分辨某些结构，例如“空心”微管，这些结构通常用作STORM成像的概念样本。

   荧光蛋白

   荧光蛋白（FPs）在结构上与合成染料不同，因此对于STORM型成像而言，其行为有很大不同。FP的通断开关有几种。“光激活” FP或PA-FP受高能（通常是紫外线-紫罗兰色）光的刺激，经历了从暗态到荧光态的不可逆转换，通常是由于发色团的结构发生了不可逆转的变化。“可逆切换” FP或RS-FP类似于PA-FP，因为它们被高频光从暗状态激活为荧光状态，但与PA-FP不同的是，它可以在两种状态之间重复切换，从而实现了多种定位相同的FP（通常通过生色团的顺反异构化来解释）。最后一类，“照片可切换” FP或PS-FP，响应于适当频率的光而经历不可逆的发射光谱偏移，最常见的是使用紫光将FP从绿色发射物质转换为红色发射物质。PS-FP是STORM型成像最常用的FP类。

   FP的显着优点是它们是可遗传编码的。但是，这也可以看作是有害的，因为（在大多数实验方法中）FP融合了过度表达的非天然蛋白，其行为可能会偏离生理规范。此外，仅一部分目的蛋白质可以被标记，导致低分子采样率，这使得难以以足够高的密度分辨细胞结构。可以使用诸如RNA沉默之类的更复杂（更密集）的方法来敲除天然蛋白质，此外，可以使用CRISPR / Cas9编辑感兴趣的基因以包括您选择的FP。应当注意，这些相同的关注点和方法也适用于基因表达的蛋白质标签，例如SNAP标签，CLIP标签，HALO标签等。

   荧光蛋白的缓冲液注意事项

   与合成染料相比，FP对成像/转换缓冲液条件的敏感度通常要低得多，它们所依赖的转换机理与合成染料基本不同。实际上，最常见的生理缓冲系统的培养基足以进行成像。FPs的激光功率也比同类合成染料低得多，这使其成为活细胞STORM应用的诱人选择。但是，与合成染料相比，FP的低光子产率严重限制了它们在固定细胞成像中的实用性。

   活细胞成像介质中不应包含酚红，因为它会产生背景信号。另外，已经显示出当对某些FP变种进行成像时，特别是在固定细胞中，低氧环境可能是有益的。一种方法是向缓冲液系统中添加1.0％（w / v）的聚乙烯醇，或使用甘油作为缓冲液基质，从而形成低透氧性的基质。可以使用酶促除氧剂，但是FP对pH的变化也很敏感。

   一个令人担忧的问题是，用于合成染料的STORM缓冲液系统的鉴定仍然可以使FP充分发挥作用，因为多通道成像通常需要将FP和染料结合起来并通过实验确定可行的“折衷缓冲液”配方。如果缓冲液包含伯硫醇（例如MEA和BME），则大多数FP的性能都会下降。在对FP成像时，几乎永远不应该使用BME，因为它们几乎总是不兼容的，但是许多FP在低MEA浓度下仍能充分发挥作用，如果可能的话，通常不超过10 mM。具体来说，已证明mEos2在使用10mM MEA / OS缓冲液与Alexa Fluor 647进行的共同成像实验中效果很好。除氧系统，例如所描述的GLOX系统，通常对FP成像无害，但使用GLOX系统进行长期成像会导致pH下降。

   除了前面列出的SMLM / STORM的荧光团质量，还应注意一些FP特定的问题。许多FP容易发生二聚化和高阶低聚产物，包括名称中带有单体“ m”描述符的许多变种，例如mEos2，它具有二聚化的趋势。尽管这对于常规成像应用或某些FP融合构造可能有问题，也可能没有问题，但在STORM的背景下，它可能导致淬灭和误导定位伪影。另一种提议的衡量SMLM FP有效性的方法是“信号传递效率”，这是庄实验室定义的，即细胞中可检测到的FP融合蛋白与其表达水平的比率。从概念上讲，这类似于确定分子采样率，

   光活化荧光蛋白

   当前，已经为STORM演示了四种PA-FP。PA-GFP是第一个发现的可光激活的FP，与原始的野生型GFP仅点突变。不幸的是，当它从黑暗荧光状态不可逆地激活时，通常发射不到300个光子。请记住，PA-FP只能被激活为荧光状态并成像一次。这使得难以解析精细的结构细节，并且还考虑到不良的光子统计，导致不良的（低精度和低密度）重建。

   PA-mCherry和PA-TagRFP的性能略好于PA-GFP，通常每个定位发射近400-800个光子，但仍不匹配更高的性能和光谱相似的PS-FP。最近，推出了可光激活的远红FP mKate版本，即PAmKate。尽管不一定胜过其他PA-FP，但仍远落后于红色和远红色合成染料的性能，但这令人兴奋，因为它似乎是STORM的第一个可用的远红色FP。由于未转化的物种无法可视化，因此PA-FP通常很难使用。这使得在没有二级标记或通过激活少量FP以便在STORM成像之前进行低光可视化的情况下，很难鉴定表达PA-FP的细胞。

   可逆转换的荧光蛋白

   RS-FP主要用于RESOLFT型超分辨率应用，而不是用于单分子定位方法（例如STORM）。RS-FP可以从暗状态可逆地转换为荧光状态，通常需要进行数百个循环，具体取决于FP。通常，RS-FP被紫外-紫罗兰色光激活，并使用更红移的波长激发荧光，这也将FP驱动回暗状态。流行的RS-FP包括Dronpa及其相关变体（Dronpa-3，bsDronpa，Padron等），可以通过低功率405 nm激光线激活，并通过低至中等功率的488 nm照明激发荧光，这也会引起荧光交换。大多数RS-FP的转换动力学非常快，尤其是对于新品种，例如RS-EGFP2，专为RESOLFT成像而设计，与STORM不兼容。RS-FP在每个周期内倾向于发射少量的光子，例如Dronpa通常每个开关周期平均发射100-200个光子。这几乎排除了在没有高灵敏度EMCCD检测器的情况下进行成像的领域，该领域越来越多地朝着具有高光子输出报告荧光团的sCMOS检测器发展。

   光开关荧光蛋白

   PS-FP通常是STORM的最合适品种。尤其是，FP的Eos系列对于STORM类型的成像长期以来一直具有很大的实用性，其实用性已在众多出版物中得到了充分证明。Eos FPs本身是绿色发射的，直到被紫外线紫光激活为止，这时它们经历不可逆的色移，变成发红光的物质。迄今为止，针对STORM的最先进的Eos品种是mEos3.2，它在切换时平均发出近1000个光子。另外，mEos3.2没有困扰许多流行FP的二聚产物，包括较早的Eos品种，例如wtEosFP，tdEos和mEos2。最近，mEos4作为高性能FP推出，用于相关STORM和电子显微镜（EM），

   将PS-FP用于STORM的主要困难在于，当考虑这两种物种时（从绿色到红色），它们都占据了较宽的光谱范围，这使得多色成像非常困难。此外，绝大多数PS-FP是绿色到红色的光电开关。值得注意的例外是PS-CFP2，即从青绿色到绿色的PS-FP。尽管PS-CFP2的光子输出与绿色至红色的PS-FPs不同，但它的占空比很低，并且光谱范围很广，几乎全部发射绿色光（蓝绿色非常暗） 。

   Dendra2是一种流行的绿色至红色PS-FP替代品，其性能与mEos2相似，但具有明显更大的单体特性，并且可以使用蓝光（488 nm）激活为红色状态，对活细胞的危害较小而不是用于激活其他探针的典型紫外线波长，这使其成为活细胞工作的诱人选择。最近，引入了绿色到红色的PS-FP mMaple改良品种– mMaple3 –证明了非常高的信号效率，低寡聚趋势以及类似于mEos3.2的光子输出。

   常规荧光蛋白

   已经证明了许多传统的（非光学高光）FP用于STORM型成像。已发布的示例包括FP mNeonGreen，EYFP和Citrine。常规FP的成像通常采用称为随机单分子超分辨率（SSMS）成像的方法，这是一种SMLM，其特征在于初始的“漂白”阶段，在该阶段中，使用过多的激光强度将FP集成体快速驱动至暗态，然后在低得多的激光强度下成像单个FP荧光的自发恢复。通常，这种方法的性能不如传统方法好，但是当研究人员已经拥有他们希望用于STORM的有效验证的FP融合蛋白时，它可能会发挥很大的作用。

   量子点

   量子点，也称为QDots，是无机半导体纳米晶体，具有许多应用，包括荧光成像。尽管QDots非常明亮和稳定，但它并不经常用于STORM类型的成像。QDots以其闪烁而闻名，它是使用超分辨率光学波动成像（SOFI）技术用于超分辨率的一种特性，但由于极短的暗态寿命而不够，因此对于STORM而言并非如此，该特性足够短以至于无法进行时空隔离使用标准方法的单个发射器的数量。相反，基于QDot的STORM成像利用了其随机发蓝特性。在恒定照明下，由于QDot核心的光氧化作用，QDots的发射光谱随机发生蓝移（这可能因QDot配方不同而有很大差异）。对蓝移且闪烁的QDots稀疏种群进行成像，可以在发射器之间进行足够的分离以应用STORM分析。但是，该技术尚未得到广泛采用，我们不建议您在未经进一步开发和标准化的情况下使用该技术。

   标签策略

   尽管荧光团的选择对于STORM成像至关重要，但同样重要的是正确标记样品。存在多种可以针对STORM进行调整的标记策略。最流行的标记策略已针对STORM进行了调整，包括免疫荧光，遗传编码的化学标签（例如FP，SNAP，CLIP等），生物正交点击标记，细胞器特异性小分子染色（例如MitoTracker标记）等等。我们将探讨每种方法的好处和陷阱。

   13-荧光标记的相对大小

   比较STORM常用标签系统的相对大小。每个标签都按比例显示并附着到微管上的单个位置（所示微管按比例缩放，特征直径为〜25 nm），以供参考。对于使用合成染料的标签，该染料会突出红色。（a）量子点，包括装饰外部的生物靶向部分。注意，量子点相对较大，导致荧光核与目标分子之间的距离很大。此插图假定使用非抗体共轭QDot标记。（b）间接免疫荧光：一抗针对靶抗原（微管蛋白），荧光标记的二抗针对一抗。抗体分子约10-15纳米宽，意味着间接标记可导致荧光团与目标分子发生20+ nm的位移。（c）直接免疫荧光：与间接标记相比，荧光标记的一抗识别抗原，从而导致更少（但仍然很明显）的分离。（d）荧光蛋白标记– FP约为2x2x4 nm，并通过短连接子序列直接与感兴趣的分子连接表达，从而使其融合伴侣仅分离了几纳米。（e）SNAP标签（和其他类似的化学标签）的大小约为FPs，但依赖于外源引入的合成染料。（f）微管蛋白特异的小分子染料：此类化学特异的染料最紧密地结合目标分子。荧光标记的一抗识别抗原，与间接标记相比，导致更少（但仍然很明显）的分离。（d）荧光蛋白标记– FP约为2x2x4 nm，并通过短连接子序列直接与感兴趣的分子连接表达，从而使其融合伴侣仅分离了几纳米。（e）SNAP标签（和其他类似的化学标签）的大小约为FPs，但依赖于外源引入的合成染料。（f）微管蛋白特异的小分子染料：此类化学特异的染料最紧密地结合目标分子。荧光标记的一抗识别抗原，与间接标记相比，导致更少（但仍然很明显）的分离。（d）荧光蛋白标记– FP约为2x2x4 nm，并通过短连接子序列直接与感兴趣的分子连接表达，从而使其融合伴侣仅分离了几纳米。（e）SNAP标签（和其他类似的化学标签）的大小约为FPs，但依赖于外源引入的合成染料。（f）微管蛋白特异的小分子染料：此类化学特异的染料最紧密地结合目标分子。（d）荧光蛋白标记– FP约为2x2x4 nm，并通过短连接子序列直接与感兴趣的分子连接表达，从而使其融合伴侣仅分离了几纳米。（e）SNAP标签（和其他类似的化学标签）的大小约为FPs，但依赖于外源引入的合成染料。（f）微管蛋白特异的小分子染料：此类化学特异的染料最紧密地结合目标分子。（d）荧光蛋白标记– FP约为2x2x4 nm，并通过短连接子序列直接与感兴趣的分子连接表达，从而使其融合伴侣仅分离了几纳米。（e）SNAP标签（和其他类似的化学标签）的大小约为FPs，但依赖于外源引入的合成染料。（f）微管蛋白特异的小分子染料：此类化学特异的染料最紧密地结合目标分子。

   免疫标记

   大多数STORM成像是对使用标准免疫荧光技术（通常是间接标记）标记的样品进行的。尽管这种方法最容易采用，但大分子抗体的应用使研究人员无法充分认识STORM的潜力。图13展示了这一限制，在视觉上显而易见的是，在应用抗体标记技术时，荧光团可以从目标分子中去除多少。如图13所示，典型的免疫球蛋白G（IgG）抗体跨度约为10-15 nm，其物理大小与大多数STORM探针的定位精度相同。因此，许多研究人员更喜欢用染料偶联的一抗标记抗原，这种方法称为直接标记，如图13（c）所示。

   间接标记的优点是能够使用许多不同的第二抗体来检测相容性宿主动物中产生的任何第一抗体，从而使其比染料偶联的第一抗体更可靠。传统上，间接标记不会造成问题，因为即使染料和抗原之间存在20+ nm的间隔，它的尺寸尺度仍比光的衍射极限所定义的大小低（约200 nm。最高NA目标）。通过使用荧光标记的二抗片段而不是整个IgG可以部分缓解此大小问题。F（ab）2片段是通过胃蛋白酶消化从IgG抗体产生的，裂解F c抗体的一部分，并产生拴在一起的一对F（ab）片段。重要的是，F c区非特异性结合细胞F c受体，这意味着F（ab）2片段的应用通常可通过减轻非特异性相互作用而产生较低的背景标记。可以用木瓜蛋白酶消化IgG，产生一对分开的F（ab）片段，大约是F（ab）2片段大小的一半。F（ab）片段也是一个不错的选择，因为像F（ab）2片段一样，它们缺乏F c受体，并且在空间位阻更为限制的情况下可以更好地到达抗原。

   最近，研究人员试图通过使用荧光标记的“纳米抗体”来解决STORM抗体带来的尺寸问题。纳米抗体，也称为单域抗体或VHH（重链可变域）抗体，每个维度的尺寸仅为1-2 nm，重约12-15 kDa（典型的抗体范围为150-160 kDa， FPs为27 kDa）。最受欢迎的纳米抗体是衍生自骆驼科动物（包括美洲驼和羊驼）中各种重链抗体的片段。

   荧光标记的纳米抗体的应用由于其体积小而显着提高了定位的定量准确性。而且，纳米抗体在拥挤的细胞环境中经历了减少的空间位阻，从而允许人们标记通常对较大的抗体（如IgG）而言是隐藏或难以接近的表位。纳米抗体也恰好比常规抗体更稳定。那么，为什么纳米抗体不能完全取代传统的抗体标记呢？在很大程度上，纳米抗体仍是一种新技术，几乎没有商业来源，除了少数靶抗原外，针对目的蛋白质的纳米抗体的产生需要成本密集的定制生产。然而，STORM成像的一种策略是使用经济高效且更容易获得的抗GFP和/或RFP纳米抗体，用高性能STORM染料标记FP标签的蛋白。这种方法很强大，因为它使研究人员可以使用他们已经知道并且熟悉的FP融合。

   荧光蛋白标记

   存在许多通过短的非结构化接头序列表达与目的蛋白融合的FP的策略。也许最简单的方法是用适当的表达载体瞬时转染细胞。质粒的导入可以使用脂质体递送系统或电穿孔轻松进行，列出了培养细胞的两种较流行的方法。与原代细胞或体内细胞一起工作时，建议使用病毒转导系统，例如腺病毒或慢病毒系统。重要的是，在尝试创建稳定表达的细胞系时，病毒载体通常是更好的选择。

   这些表达系统的最大局限之一是研究人员并未标记天然蛋白质，如前所述。最近，CRISPR / Cas9系统在基因组编辑应用中变得非常流行。具体地，这允许编辑天然基因以包括FP，并且是纯合的或杂合的。另一个选择是敲低天然基因的表达。但是，这两种方法都非常耗时，并且需要针对任何给定的FP融合构建体进行广泛验证。

   FPs是活细胞STORM型成像的有价值的标签，因为它们是基因表达的，相对较小并且距离其融合伴侣不远。FP在活细胞中经常被忽略的另一个优点是，它们的翻转和更换相对较快，非常适合在多个时间点对同一细胞成像。STORM荧光蛋白的最弱点可能是其低光子输出。

   SNAP标签贴标

   SNAP标签是人类DNA修复蛋白O 6的突变形式-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶（hAGT）。该蛋白质与苄基鸟嘌呤（BG）和BG官能化的分子快速发生生物正交反应。简而言之，SNAP标签融合蛋白在细胞中的表达与表达FP融合蛋白的技术相同。所选的BG官能化STORM染料被添加到细胞环境中，与该染料和表达的SNAP-tag融合蛋白发生反应并形成一个高度稳定的共价键。存在许多类似的标记系统，甚至可以与SNAP标签并行使用。其中包括CLIP标签，HALO标签，TMP标签，FLAG标签等。但是，SNAP标签系统已针对STORM成像进行了最彻底的验证。

   通常，SNAP标签最常用于活细胞成像。细胞可渗透的染料BG衍生物可以进行实时成像，尽管可用的细胞可渗透的染料偶联物的性能与性能更高的细胞不可渗透的染料Alexa Fluor 647不相等。这使得难以以必要的时空分辨率进行实时成像。有关SNAP标签和相关系统的常见抱怨是它们本身是非荧光的，需要添加外源（且昂贵）的功能化染料才能进行可视化。与FP表达相比，这使得SNAP标签表达的筛选更加困难且费时。另外，

    生物专用小分子染料标签

   壮实验室首次展示了许多常见的亲脂性和膜性染色剂对活细胞STORM成像的实用性。这样的染料通常是小的，带电的，细胞可渗透的，并且对目标结构具有高亲和力。重要的是，这些污渍往往会以高密度聚集，从而可以以非常高的采样率进行超结构和拓扑成像。但是，请注意，这些标记中的大多数是细胞器特异性的，而不是分子特异性的。

   可以使用亲脂性花青染料DiI（红色），DiD（远红色）和DiR（近红外）对质膜成像。线粒体的活细胞STORM成像可以使用MitoTracker橙色和红色进行，这两种都是阳离子罗莎明染料。也可以使用阳离子远红花青染料MitoTracker深红色，其结构类似于Cy5和Alexa Fluor647。BODIPY衍生物ER-Tracker Red和LysoTracker Red适用于内质网和溶酶体的活细胞STORM，分别。毫无疑问，许多其他亲脂性污渍也可用于STORM，但需要验证。

   这些活细胞膜染色剂的成像缓冲液是包含氧气清除系统（例如GLOX）和2％葡萄糖的培养基。像活细胞SNAP标签成像一样，此方法依赖于浓度为毫摩尔的内源硫醇谷胱甘肽的存在，以代替外源硫醇或其他还原剂作为还原剂。但是，已证明添加了少量MEA和其他还原剂的活细胞STORM。

   有几种生物特异性小分子染料不依赖亲脂性或电荷依赖性积累。也许最受欢迎的是鬼笔环肽缀合物（例如鬼笔环肽-Alexa Fluor 647）。毒肽如鬼笔环肽和phallacidin导出从鹅膏 蕈蘑，并结合排他地丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）。请注意，用鬼笔环肽缀合物进行标记和成像只能在染色过程中未暴露于甲醇的固定细胞中进行。鬼笔环肽-Alexa Fluor 647特别显示在大功率照明下可与肌动蛋白脱开。还使用标记的小麦胚芽凝集素（WGA）证明了STORM，这是一种主要针对反式高尔基体网络中某些糖基化蛋白质和脂质的凝集素。

   可以将用适当染料标记的纯化蛋白引入细胞环境进行成像。例如，用Alexa Fluor 647标记的转铁蛋白和表皮生长因子（EGF）已显示被活细胞内吞并使用STORM成像。

   如前所述，几种核染色剂已被证明与STORM兼容，包括DAPI，几种Hoechst染料和Vybrant DyeCycle紫罗兰。此外，YOYO-1和SYTO-13都是对DNA特有的花青染料，并且已经过STORM成像验证。用于STORM成像的荧光染料比许多人想象的要多，仅需要实验验证和优化即可。特别是许多DNA探针已被证明是有价值的。

    生物正交点击标签

   标记修饰的细胞成分的一种有效方法是点击化学。具体而言，铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应（CuAAC）是一种完全生物正交的方法，用于用含有叠氮化物官能团的染料衍生物标记炔烃官能化的细胞组分。也许最好的例子是用炔烃官能化的胸苷类似物EdU标记DNA。例如，用EdU脉冲并随后进行固定，并使用叠氮化物官能化的染料（例如Alexa Fluor 647叠氮化物）进行标记，可以对新合成的DNA进行超分辨率STORM成像。尽管由于铜的细胞毒性和探针渗透性问题，此类研究在很大程度上局限于固定细胞，但我们希望新近可用的无铜点击化学将导致活细胞成像解决方案。

    绘画方法

   纳米级地形成像（PAINT）显微镜中成像的点累积在概念上与STORM相似，单个发射事件在时间和空间上被隔离并定位在亚衍射限制的区域，具有足够的数据点，结果是使用大大提高了空间分辨率。但是，PAINT并不是通过典型的开关机制将荧光团永久固定在目标结构上，以进行重复的成像，而是依靠探针与目标结构的瞬时结合。瞬态结合发生在足够短的时间尺度上，以至于不需要眨眼即可隔离单个发射器，而是由于探针的固定化而在结合时观察到荧光“尖峰”，此后探针迅速解离和/或发生光漂白，让新的探针代替它。PAINT最初于2006年得到证明，使用染料尼罗红对大型单层囊泡进行成像。重要的是，理论上无数的发射事件可用于构建具有PAINT的超分辨率重建，仅受运行实验所需的时间和试剂的限制。这一点非常重要，因为对PAINT进行了内在优化以最大化分子采样率。

   与STORM一样，PAINT受兼容探头可用性的限制。对于单分子定位，需要在合适的时间尺度上进行结合-结合时间短，对于高质量的定位测量，不能整合足够的信号，而结合时间长，发射器的时空分离将成为问题。PAINT的另一个局限性是背景荧光高，即使使用强荧光探针也是如此。这将技术限制为与强光学切片方法（例如TIRF或旋转磁盘）结合使用。主要通过亲脂性探针优先定位于某些膜结合的细胞结构（包括溶酶体，高尔基体网络，内质网，质膜，线粒体等）证明了PAINT 但不与特定的分子种类相关联。因此，该技术最初是作为“地形”方法引入的。

   图14-使用尼康N-STORM 4.0的Lamin A / C的3D DNA-PAINT

   使用Nikon N-STORM 4.0系统获得的固定CV-1细胞中核纤层蛋白Lamin A / C的3D DNA-PAINT图像。使用基于3D散光的单分子定位和Nikon的Perfect Focus系统结合可变角度斜向照明进行z步进，获得5.1微米厚的z堆栈，以实现高信噪比成像。以每帧30 ms，每z平面15,000帧和以100 nm间隔获取的51 z平面的速率执行成像。使用结合到Ultivue Inc.对接链上的山羊抗兔第二抗体标记Lamin A / C一抗。相应的成像链用专有的远红色荧光团标记（646 ex / 664 em），并在成像前以1 nM的浓度添加到提供的成像缓冲液中。使用647 nm激光线激发荧光，并通过Hamamatsu ORCA-Flash 4.0 V2 sCMOS相机进行检测。使用基于图像的自相关进行漂移校正。重建中代表了超过380万个本地化版本。（a）具有颜色编码z位置的2D图像。（b）3D体积渲染。（ch）代表性的单个z平面，其深度在每个面板的左下方表示。

   通过使用短DNA寡聚物（oligos）标记的抗体，探针特异性正在取得进展，这种技术被称为DNA-PAINT。这些寡核苷酸经过工程改造，对互补染料标记的寡核苷酸具有相对较低的亲和力，互补的染料标记的寡核苷酸被引入系统并短暂结合，从而可以连续补充荧光标记的寡核苷酸，从而实现理论上无限的检测和定位次数。给定抗原的分子特异性（图14）。通过使用针对不同抗原的一抗以及结合到具有不同序列的寡核苷酸的不同抗体，可以进行多通道检测，允许人们依次引入具有相同高性能染料的不同寡聚物（称为Exchange-PAINT），或同时使用携带光谱不同染料的寡聚物。这种方法可产生极高的分辨率，几乎没有串扰，并且不会因色差（假设使用Exchange-PAINT）而在不同通道之间产生配准错误。已证明Exchange-PAINT可用于10色超分辨率成像，平均定位精度低于10 nm。Ultivue Inc.最近将DNA-PAINT商业化，有望对该技术进行标准化。已证明Exchange-PAINT可用于10色超分辨率成像，平均定位精度低于10 nm。Ultivue Inc.最近将DNA-PAINT商业化，有望对该技术进行标准化。已证明Exchange-PAINT可用于10色超分辨率成像，平均定位精度低于10 nm。Ultivue Inc.最近将DNA-PAINT商业化，有望对该技术进行标准化。

    多标签策略

   由于有许多不同的可用标记策略，因此在同一实验中混合搭配方法是非常普遍的。这种情况下的主要局限性不是对同一样本进行不同类型标记的能力（例如，将基于抗体的检测与SNAP标签混合），而是识别适用于具有不同开关化学性质的荧光团的“妥协缓冲液” 。虽然在使用相同类型的荧光团（例如所有合成染料）时通常不会出现问题，但在将合成染料和FP标签混合使用时可能会令人望而却步。FP倾向于在还原和氧化缓冲液系统中表现不佳，这是Alexa Fluor 647等高性能染料所要求的。但是，某些品种，例如mEos2，比其他品种更能抵抗这种环境条件。任何状况之下，如果需要在还原缓冲液系统中对FP成像，请使还原剂的浓度尽可能低（小于或等于10mM）。一种有前途但尚未开发的方法是将FP和PAINT标记方法混合使用，因为这两种方法都是在生理缓冲液中进行的。

    结论

   STORM成像技术提供了前所未有的分辨率，打破了曾经被认为是数百年来光学显微镜的基本限制。尽管STORM的实用性很强，但许多STORM成像实验的失败不是由于成像技术，而是由于样品制备。也许比其他任何荧光显微镜更重要的是，STORM需要严格注意荧光团的选择，标记方法和缓冲液的选择，以成功成像-在这项工作中，我们特别注意检查STORM的状态并解决这些问题。应当指出，单分子定位领域的进步正在迅速发生，因此对这项技术的应用感兴趣的研究人员应该意识到新兴的解决方案，例如用于超高采样率的PAINT方法。